ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА Российский патент 2007 года по МПК A61K31/7105 A61K9/127 

Описание патента на изобретение RU2306936C2

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, в частности к интерфероногенным противовирусным препаратам на основе двуспиральной РНК (дсРНК).

В клинической практике для регуляции интерфероногенеза и лечения вирусных инфекций, в частности гепатита С, гриппа, ВИЧ-инфекции и др., применяются препараты на основе дсРНК, полученной из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вследствие нестойкости и биодеградируемости дсРНК в физиологической среде желудочно-кишечного тракта известные индукторы при пероральном введении практически не проявляют интерферониндуцирующей активности. Как следствие, препараты используются только для инъекций, что является их существенным недостатком, так как, с одной стороны, введение препарата связано с известными неудобствами для пациентов, с другой стороны, при проведении инъекций существует риск инфицирования пациентов вирусами ВИЧ и гепатита.

Попытки создания высокомолекулярных индукторов эндогенного интерферола на основе дсРНК для перорального применения предпринимались разными исследователями. Наиболее близким аналогом заявляемого препарата является липосомальный препарат, содержащий дсРНК, которая представляет собой репликативную форму бактериофага f2, выделенную из бактерий Е.coli. Этот препарат при пероральном применении проявлял высокую интерферониндуцирующую активность в экспериментах на животных. (См. "Вопросы вирусологии", 1987, том 32, №3, С.352-357.)

Однако проведенные исследования показали, что препарат на основе фаговой дсРНК обладал повышенной токсичностью и мутагенной активностью (Р.А.Кукайн и др. «Индукторы интерферона», Рига «Зинатне», 1981, С.40; Сборник научных трудов сотрудников НИКТИ БАВ под редакцией В.И.Масычевой, Бердск, 1996, С.66). Вероятно, это стало причиной того, что препараты на основе фаговой дсРНК пока не применяются в медицине.

Таким образом, в настоящее время в лечебной практике высокомолекулярные индукторы на основе дсРНК применяютя только инъекционно и местно, а самый удобный и естественный путь введения лекарств через рот не используется.

Задачей настоящею изобретения является создание лекарственного препарата, обеспечивающего при пероральном введении в организм млекопитающих, включая человека, высокоэффективную индукцию эндогенного интерферона без проявления острой и системной токсичности.

Поставленная задача решается за счет того, что липосомальный индуктор интерферона на основе двуспиральной РНК содержит водно-солевой раствор двуспиральной РНК дрожжей, одноцепочечную высокополимерную РНК киллерных дрожжей, а также фосфатидилхолин, холестерин, альфа-токоферола ацетат (витамин Е) и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мг/мл:

двуспиральная РНК0,5-2,0одноцепочечная высокополимерная РНК4,5-8,0фосфатидилхолин60,0-90,0холестерин8,0-10,0альфа-токоферола ацетат8,0-10,0сахароза60,0-90,0натрия хлорид3,0-6,0водадо 1,0 мл

Лекарственный препарат представляет собой липосомальную композицию на основе водно-солевого раствора деРНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae с рН 6,5-7,5 или лиофилизат.

Входящие в состав липосомальной мембраны фосфатидилхолин, холестерин и витамин Е в заявленных соотношениях обеспечивают требуемую стабильность липосом в физиологических условиях желудочно-кишечною тракта до места всасывания препарата (проксимальная часть тонкого кишечника) и соответственно сохранение интерферониндуцирующей активности дсРНК, заключенной в них. Заявляемое соотношение липосомообразующих компонентов и нуклеотидного материала оптимально для включения активного начала в липосомы. Коэффициент включения дсРНК составляет 55-65%. Липосомальная композиция предлагаемого состава обеспечивает сохранение высокой биологической активности дрожжевой дсРНК не только в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта, но и при производстве и хранении препарата. Входящая в состав предлагаемого препарата одноцепочечная высокополимерная РНК дрожжей при заявленном содержании делает препарат нетоксичным in vitro и in vivo, a значит фармацевтически приемлемым.

Липосомальный индуктор интерферона заявленного состава получают модифицированным методом экструзии мультиламеллярных везикул через ядерные мембраны, полученные на основе полиэтилентерефталатной пленки.

Пример. В круглодонную колбу объемом 2 л вносят в виде 10% спиртового раствора 90 г фосфатидилхолина, 10 г холестерина, растворенного в следовых количествах хлороформа, и 10 г альфа-токоферола ацетата в виде 98% масляного раствора, после чего смесь выпаривают под вакуумом до получения на стенках колбы тонкой липидной пленки. После выпаривания с целью предотвращения перекисного окисления липидов пленку продувают инертным газом (аргон высокой чистоты). Готовят гидратационный раствор, содержащий 10 г смеси дсРНК и впРНК (весовое отношение 1:5), 88 г сахарозы в 1 л 0,05 М раствора хлористого натрия. Добавляют гидратационную смесь в колбу с липидной пленкой, после чего колбу встряхивают до полной гидратации липидов. Получившуюся грубую липосомальную суспензию гомогенизируют путем последовательной многократной формирующей экструзии через ядерные мембраны (диаметр пор 1-0,2 мкм) под давлением инертного газа (аргон высокой частоты) до получения однородной липосомальной суспензии со средним диаметром частиц 0,22-0,25 мкм. Весь технологический процесс проводят при температуре 30,0±5,0°С. Затем готовый препарат подвергают стерилизующей фильтрации, розливу во флаконы и лиофилизации.

При анализе липосомальной суспензии установлено, что большая часть нуклеотидного материала ассоциирована с липосомами, поэтому предлагаемый препарат целесообразно использовать в терапевтических целях без отделения невключившегося вещества.

Заявляемый препарат представляет собой липосомальную композицию на основе водно-солевого раствора дрожжевой дсРНК, которую в асептических условиях разливают по 1 мл во флаконы, замораживают при температуре минус 30-50°С, после чего лиофильно (сублимационно) высушивают в течение 36-48 час. Сразу после сушки флаконы с препаратом герметично укупоривают в атмосфере инертного газа в асептических условиях.

Непосредственно перед употреблением к сухому препарату добавляют 1 мл дистиллированной воды, после чего флакон непрерывно встряхивают до получения однородной липосомальной суспензии молочно-белого цвета.

Стабильность лиофильно высушенного липосомального препарата дсРНК, хранившегося в течение года при температуре 4°С, определялась по накоплению в нем перекисей липидов и по сохранению его интерферониндуцирующей активности (см. «Methods Enzymol., 1984, vol.105, p.328-333). Интерферон определяли в сыворотке крови мышей через различные сроки после введения препарата. В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей. За единицу активности интерферона принимали величину, обратную разведению интерферона, при котором наблюдалась защита 50% клеток культуры от 100 ЦПД50 тест-вируса (см. «Бюл. экспериментальной биологии. - 1984, №4, С.446-447).

Установлено, что в течение годичного срока хранения снижения интерферониндуцирующей активности заявляемого лекарственного средства и значимого накопления в нем перекисей липидов не происходит (см. таблицу 1).

Таблица 1Параметры препаратаСрок хранения1 день6 мес12 месИнтерферониндуцирующая активность in vitro, ИЕ/мл128010241280Накопление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), нмоль Мда/мг0,2300,2450,265

Исследование терапевтической эффективности заявляемого лекарственного средства проводили путем испытаний на белых мышах и в культуре клеток L-929. В эксперименте исследовалась интерферониндуцирующая активность лиофильно высушенного липосомального препарата дсРНК для перорального применения. Полученные данные сопоставляли с характеристиками выбранного аналога известными из литературы (см. "Вопросы вирусологии", 1987, том 32, №3, С.352-357).

В таблице 2 приведены данные, характеризующие количественное содержание интерферона и сыворотках подопытных животных после воздействия известным и заявляемым индукторами интерферона. Показаны временные точки, в которых продукция сывороточного ингерферона достигает пиковых значений. Полученные результаты свидетельствуют о том, что пероральное введение заявляемого липосомального индуктора на основе дсРНК киллерных дрожжей на пике продукции сопровождается выходом в кровь значительных (640-1280 ИЕ/мл) количеств интерферона, существенно превышающих уровень интерферона при пероральном введении известного индуктора. Причем превышение характерно практически для всех исследованных временных интервалов после введения препарата, так что общее количество интерферона, индуцированного заявляемой лекарственной формой, существенно выше.

Таблица 2
Интерфероногенная активность заявляемого и известного липосомальных индукторов при пероральном введении (субъект испытаний - мыши, доза - 5 мг/кг)
Наименование препаратаИнтерфероноиндуцирующая активность in vitro, ИЕ/млВремя после введения препарата, час691524Заявляемый липосомальный препарат при введении per os320-640640-1280640-128080-160Липосомальный препарат фаговой деРНК при введении per os320-480320-480160-32080-160

Экспериментальное изучение предлагаемого препарата показало, что он является активным индуктором интерферона при пероральном введении животным, при этом каких-либо токсических проявлений у животных после воздействия на них препарата отмечено не было. Проведенные нами исследования показали, что величина LD50 при внутрибрюшинном введении заявляемого препарата составляет 394,8 мг/кг массы животного, что позволяет говорить о нем как о практически нетоксичном препарате.

Результаты испытаний предлагаемого препарата свидетельствуют о том, что заявляемый липосомальный индуктор интерферона, обладающий при его пероральном применении высокой интерферониндуцирующей активностью и не дающий побочных эффектов, может применяться в клинической практике в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний вирусной этиологии и в других случаях, когда предписано назначение индукторов эндогенного интерферона.

Похожие патенты RU2306936C2

название год авторы номер документа
ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ 1999
  • Левагина Г.М.
  • Аликин Ю.С.
  • Масычева В.И.
  • Даниленко Е.Д.
  • Фадина В.А.
  • Игнатьев Г.М.
RU2172631C2
ЛЕГКО ПРОНИКАЮЩИЙ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ МЫЛКИЙ АМФИФИЛЬНЫЙ ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА γ 2012
  • Ямковая Татьяна Витальевна
  • Колесникова Ольга Петровна
  • Загребельный Станислав Николаевич
  • Панин Лев Евгеньевич
  • Ямковой Виталий Иванович
RU2496783C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ 2003
  • Бажутина Наталья Владимировна
  • Бажутин Николай Борисович
  • Белова Наталья Васильевна
  • Гурьева Татьяна Леонидовна
  • Гурьев Владимир Павлович
  • Дегтева Светлана Альбертовна
  • Еникеева Раиса Вильевна
  • Золин Владимир Викторович
  • Комарова Татьяна Леонидовна
  • Колокольцов Алексей Александрович
  • Моисеенкова Ольга Афанасьевна
  • Наумова Нина Васильевна
  • Остапенко Елена Витальевна
  • Пикалова Марина Ивановна
  • Самотяжко Земфира Марсовна
  • Таргонский Сергей Николаевич
  • Шарафаненко Ольга Викторовна
  • Шамрина Лариса Викторовна
RU2302464C2
ЛИПОСОМАЛЬНОЕ ПЕРОРАЛЬНОЕ ПРОТИВОВИРУСНОЕ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА 2008
  • Таргонский Сергей Николаевич
  • Бажутин Николай Борисович
  • Войтенко Александр Васильевич
  • Хомичёв Вадим Валентинович
RU2361572C1
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РЕЦИДИВИРУЮЩЕГО УРОГЕНИТАЛЬНОГО ГЕРПЕСА С СИМПТОМАМИ ХРОНИЧЕСКОЙ УСТАЛОСТИ 2012
  • Таргонский Сергей Николаевич
  • Усова Светлана Владимировна
  • Бажутин Николай Борисович
  • Мухина Ольга Николаевна
  • Шарыпова Марьяна Григорьевна
RU2492861C1
ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ 2003
  • Золин В.В.
  • Агафонова О.А.
  • Колокольцов А.А.
  • Таргонский С.Н.
  • Бажутин Н.Б.
RU2255735C2
СУППОЗИТОРИИ ИНДУКТОРА ИНТЕРФЕРОНА 2005
  • Левагина Галина Михайловна
  • Масычева Валентина Ивановна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
RU2328272C2
Способ получения липидной смеси и липосомальное пероральное противовирусное лечебно-профилактическое средство с использованием указанной липидной смеси 2020
  • Прищенко Анастасия Викторовна
  • Таргонская Оксана Викторовна
  • Таргонский Сергей Николаевич
RU2746320C1
ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА РИДОСТИН 1993
  • Аликин Ю.С.
  • Веревкина К.Н.
  • Дубатолова Т.Д.
  • Дужак А.Б.
  • Костомаха А.Н.
  • Лобова Н.Н.
  • Масычева В.И.
  • Морозова Е.Н.
  • Надолинная И.Г.
  • Подгорный В.Ф.
  • Пупкова В.И.
  • Штань А.В.
  • Ершов Ф.И.
RU2083221C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУСПИРАЛЬНОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (дсРНК) ИЗ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae 2014
  • Аликин Юрий Серафимович
  • Подгорный Владимир Федорович
  • Лебедев Леонид Рудольфович
  • Азаев Мамедьяр Шакирович
RU2558256C1

Реферат патента 2007 года ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ИНДУКТОР ИНТЕРФЕРОНА

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтической промышленности, и касается липосомального индуктора интерферона. Сущность изобретения: липосомальный индуктор интерферона представляет собой водно-солевой раствор двуцепочечной РНК, полученной из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, одноцепочечную высокополимерную РНК дрожжей, фосфатидилхолин, холестерин, альфа-токоферола ацетат, сахарозу и хлорид натрия. Преимущество изобретения заключается в повышении активности при пероральном введении. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения RU 2 306 936 C2

1. Липосомальный индуктор интерферона, на основе двуспиральной РНК, отличающийся тем, что содержит водно-солевой раствор двуспиральной РНК дрожжей, одноцепочечную высокополимерную РНК дрожжей, фосфатидилхолин, холестерин, альфа-токоферола ацетат и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мг/мл:

двуспиральная РНК0,5-2,0одноцепочечная высокополимерная РНК4,5-8,0фосфатидилхолин60,0-90,0холестерин8,0-10,0альфа-токоферола ацетат8,0-10,0сахароза60,0-90,0натрия хлорид3,0-6,0водадо 1,0 мл

2. Липосомальный индуктор интерферона по п.1, отличающийся тем, что он представляет собой лиофилизат.3. Липосомальный индуктор интерферона по п.1, отличающийся тем, что он представляет собой липосомальную композицию на основе водно-солевого раствора двуспиральной РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae с рН 6,5-7,5.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2306936C2

ГРИГОРЯН С.С
и др
Интерферониндуцирующая активность липосомвключенных двухцепочечных полинуклеотидов и средства для ее повышения
Вопр
вирусол., 1987, т.32, №3, стр.352-357
Способ индукции интерферона 1981
  • Григорян Седа Суреновна
  • Джумаев Джурабай Боратович
  • Ершов Феликс Иванович
  • Жданов Виктор Михайлович
  • Поверенный Александр Михайлович
  • Подгородниченко Владимир Константинович
  • Попов Геннадий Александрович
SU1135477A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
GRIGORIAN S.S
et al., Interferon induction via peroral administration of high molecular polynucleotides, Vopr
Virusol., 1986, May-Jun., v.31, №3, pp.338-348.

RU 2 306 936 C2

Авторы

Золин Владимир Викторович

Колокольцов Алексей Александрович

Таргонский Сергей Николаевич

Бажутин Николай Борисович

Войтенко Александр Васильевич

Даты

2007-09-27Публикация

2004-02-25Подача