ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам из лекарственных растений, обладающим противовирусной активностью.

Известно биологически активное вещество против вируса СПИД из листьев облепихи крушиновидной (Пат. СССР N 1805968, приоритет 03.11.87), а также способ его получения (Пат. СССР N 1494273, приоритет 11.08.87), в котором показана противовирусная активность на вирусах гриппа A и герпеса. Других сведений о противовирусной активности экстракта из облепихи нет.

Гипорамин представляет собой сумму полифенольных соединений из листьев облепихи крушиновидной, содержащую не менее 60% галлоэллаготаннинов. Биологически активными компонентами препарата являются гидролизуемые таннины, в том числе стриктинин (C₂₇H₂₂O₁₀ • 2,5H₂O), изостриктинин (C₂₇H₂₂O₁₈ • H₂O), казуаринин (C₄₁H₂₈O₂₆ • 7H₂O), гипофенин B (C₄₈H₃₂O₃₁), казуариктин (C₄₁H₂₈O₂₆ • 6H₂O).

Из анализа опубликованных данных о противовирусной активности известных лечебных средств, применяемых в медицине (ремантадин, оксолин, бонафтон), следует, что антивирусное действие препаратов зависит от структуры активных соединений. Однако этих данных недостаточно для прогнозирования противовирусной активности в отношении спектра действия. Например, ремантадин, используемый для лечения гриппа A, не активен в отношении вируса гриппа B. Таким образом, факт наличия противовирусной активности у известных соединений в отношении определенных вирусов не является достаточным критерием наличия чувствительности к этим препаратам других, даже близкородственных видов вирусов.

Целью настоящего изобретения является расширение области применения гипорамина за счет выявления новых свойств препарата. Экспериментально установлено, что гипорамин наряду с известным ранее действием на вирус гриппа A обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа B, аденовируса второго типа, парамиксовирусов 1 и 2 типов и некоторых других вирусов, патогенных для человека и животных. Выявлено также его интерферониндуцирующее свойство.

Изобретательский уровень заключается в выявлении новой совокупности признаков (спектра противовирусной активности), которая в известных решениях не найдена. Аналогичный препарат из листьев облепихи крушиновидной с указанием спектра противовирусной активности в отечественной или зарубежной литературе не описан.

С заявляемыми свойствами гипорамин получают из листьев облепихи крушиновидной экстракцией водным органическим растворителем, например, ацетоном, удалением органического растворителя, обработкой водного раствора двухкомпонентной смесью алифатического углеводорода с бутиловым спиртом, концентрированием водной фазы с последующим высушиванием водного концентрата. Ниже приведен конкретный пример его приготовления: 50 г измельченных листьев облепихи крушиновидной с содержанием таннинов 21,5% и влажностью 7,1% заливают 0,5 л 50%-ного водного ацетона, через 1 ч сливают экстракт, к сырью добавляют свежий растворитель, равный объему слива. Таким образом приводят еще три экстракции. Водно-ацетоновые экстракты объединяют и упаривают до объема 0,3 л. Водный кубовый остаток пятикратно обрабатывают смесью нефраса с бутиловым спиртом (2: 1) в соотношении 1:1, водную фазу упаривают до 0,1 л и сушат на лиофильной сушилке (время сушки 20 ч). Выход 16,30 г (32,5% от массы сырья) с содержанием таннинов в препарате 64,05% (с учетом влаги в образце).

Сравнительное изучение противовирусной активности гипорамина в отношении вируса гриппа человека типа A, получаемого по приведенному способу, с гипорамином, получаемым по патенту N 1805965, показало, что гипорамин, получаемый по приведенному способу, обладает высоким вируснейтрализующим действием в отношении вируса гриппа человека типа A /Aichi/2/689 (H3N2). При этом противовирусная активность препарата, получаемого приведенным способом, не уступает гипорамину, получаемому по патенту N 1805965 (см. таблицу 1). Дополнительным преимуществом гипорамина по сравнению с прототипом является его активность в отношении спектра эпидемических штаммов вируса гриппа A с различной антигенной структурой, в т. ч. вируса гриппа человека А/Англия (H1N1), А/СССР/903/77 (N1N1) А/Бангкок/1/79 (H3N2), А/Филиппины/2/82 (N2N2) , А/Сингапур/52 (N2N2) и птиц А/Чайка/Астрахань/777/89 (H13N6).

Особенностью гипорамина является широкий спектр противовирусной активности в отношении различных вирусов, патогенных для человека и животных, в том числе вируса гриппа B, парамиксовирусов 1 и 2 серотипов, аденовирусов типа 2. Отличительной чертой препарата является непосредственное воздействие на патогенный вирус на ранних стадиях взаимодействия вируса с клеткой и наличие интерферониндуцирующей активности.

По параметрам среднесмертельных доз при внутрибрюшинных инъекциях субстанция гипорамина относится к IV классу - малотоксичным веществам (ЛД₅₀ для белых мышей самцов и самок - 106,7±8,9 и 103,3±7,7 мг/кг, крыс самцов и самок 170,0±13,3 и 140,0±9,7 мг/кг соответственно; крысят 4-недельного возраста - 140,0±6,7 мг/кг, морских свинок - 128,0±6,6 мг/кг); при введении в желудок - к ряду практически нетоксичных (V класс) соединений ЛД₅₀ - для белых крыс самцов и самок - 9500,9±984,9 и 8400,0±783,3 мг/кг, соответственно; для крысят - 9900,0±554,9 мг/кг). Гипорамин не обладает аллергизирующими, мутагенными, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами; не вызывает изменение иммунного статуса подопытных животных. Документация по доклиническому изучению гипорамина передана в Фармакологический Государственный Комитет МЗ РФ и получено разрешение на его клинические испытания: протокол N 20 и 10 декабря 1992 года (I фаза клинических испытаний) и протокол N 3 от 9 февраля 1994 гола (II фаза клинических испытаний).

Ниже приведены конкретные примеры экспериментального изучения гипорамина.

Пример 1. Изучение вируснейтрализующей активности в системе куриного эмбриона проводили с использованием вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Вируснейтрализующее действие гипорамина изучали в контактных опытах in vitro и индикацией на куриных эмбрионах. Препарат растворяли в буферном растворе с pH 7,2-7,4 и смешивали с 1,10,100 и 1000 ЭИД₁₀₀ вируса гриппа, получая конечные концентрации препарата 100, 10, 5 и 2,5 мкг/мл. Смеси препарата с вирусом выдерживали в течение 1 часа при температуре 4^oC, после чего вводили в объеме 0,2 мл в аллатоисную полость 9-10 дневных интактных эмбрионов. Через 48 часов куриные эмбрионы вскрывали и в аллантоисной жидкости определяли наличие вируса методом реакции гемагглютинации (РГА). Активность выражали количеством нейтрализованных эмбриональных инфекционных доз (ЭИД) вируса гриппа. Опыты проводили в нескольких повторностях. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Исследование в отношении вируса гриппа штамм A/Aicha/2/68/ (H3N2) показало, что гипорамин, получаемый по приведенному способу, обладает высоким вируснейтрализующим действием в отношении вируса гриппа A. При этом противовирусная активность гипорамина, получаемого по приведенному способу, не уступает противовирусной активности гипорамина, получаемого по патенту N 1805965 и взятого в качестве прототипа.

Пример 2. Изучение вируснейтрализующей активности гипорамина в отношении вируса гриппа B проведено в системе куриного эмбриона с использованием вируса гриппа B (Сингапур) 79. Вируснейтрализующую активность гипорамина изучали в контактных опытах in vitro с индикацией на куриных эмбрионах. Препарат растворяли в буферном растворе с pH 7,2-7,4 в концентрациях 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг, 500 и 1000 мкг/мл и смешивали с 1, 10, 100 и 1000 ЭИД₁₀₀ вируса гриппа. Смеси препарата с вирусом выдерживали в течение 1 часа при температуре 4^oC, после чего вводили в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость 9-10-дневных интактных куриных эмбрионов. Через 48 часов куриные эмбрионы вскрывали, в аллантоисной жидкости определяли наличие вируса методом реакции гемагглютинации (РГА). Активность выражали количеством нейтрализованных эмбриональных инфекционных доз (ЭИД) вируса гриппа. Изучение вируснейтрализующей активности гипорамина в отношении вируса гриппа B показало, что гипорамин в концентрациях 100, 500 и 1000 мкг/мл практически полностью нейтрализовал репродукцию вируса гриппа B (Сингапур) 79 на 3,75 ± lg ЭИД₅₀. Изучение минимальной вирусингибирующей концентрации (МИК) показало, что для вируса гриппа B эта концентрация составила не более 10 мкг/эмбрион.

Пример 3.Изучение химиотерапевтической эффективности гипорамина при экспериментальной гриппозной пневмонии белых мышей. Для заражения использовали вирус гриппа B (Сингапур) 222/79, 10^-1 - 100 ЛД₅₀. Изучение химиотерапевтической эффективности гипорамина при экспериментальной гриппозной пневмонии проводили на белых безлинейных мышах массой 15 г. Животных заражали интраназально вируссодержащей жидкостью в объеме 0,05 мл под легким эфирным наркозом в разведении, обеспечивающем 80-90% гибели животных. Лечение животных проводили трехкратно: за три часа до инфицирования, затем на вторые и четвертые сутки после инфицирования. В опыте использовали аэрозольный способ введения препарата. Источником аэрозоля служил ультразвуковой генератор производства ГДР. Аппарат позволял получать аэрозоли со следующим объемным фракционно-дисперсионным составом частиц и размером от 0 до 1 мкм - 2%, от 1 до 2 мкм - 10%, от 2 до 5 мкм - 80%, от 5 до 7 мкм - 8%. Для введения препарата в виде аэрозоля мышей помещали в пластиковую камеру емкостью 16 л. Объем камеры был выбран из такого расчета, чтобы по условиям предельных концентраций кислорода и углекислого газа можно было экспонировать 40 животных в аэрозольном облаке в течение 20 мин после прекращения подачи аэрозоля. Разовая доза, получаемая каждой мышью, соответствовала 40 мг на 1 кг массы животного или в пересчете на фактическую массу животного 0,6 мг/мышь (600 мкг/мышь). В группах было по 40 животных. Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 дней. В результате исследования установлено, что при использовании аэрозольного метода введения гипорамин проявляет наиболее выраженный защитный эффект при трехкратном введении препарата: в этой группе наблюдалась наименьшая гибель мышей. И срок гибели мышей сдвигался на сутки по сравнению с контролем. Увеличение дозы препарата вдвое (до 1500 мкг/мышь) приводило к увеличению продолжительности срока жизни в опытных группах (+ сутки).

Пример 4. Изучение химиотерапевтического действия гипорамина на парамиксовирусную инфекцию. При изучении действия гипорамина на репродукцию ПМВ птиц 1 и 2 серотипов была использована культура клеток "Vero". В предварительных опытах была установлена максимально переносимая концентрация 100 мкг/мл гипорамина, не вызывающая видимых цитотоксических изменений в монослое клеток "Vero". Культуру клеток "Vero" культивировали в 24-луночных панелях в течение 48-72 ч и инфицировали ПМВ птиц 1 и 2 серотипов в дозе 5•10⁷ и 6•10 ⁷ЛД₅₀. Гипорамин вносили в дозах 50, 10, 5 и 2,5 мкг/мл. После адсорбции (1 час при температуре 37^oC) инокулят удаляли, клетки отмывали средой 199 и добавляли среду с 10 мкг/мл трипсина. Эффективность действия гипорамина оценивали по снижению гемагглютинирующих титров вирусов. Установлено, что через 48-72 ч инфекционный титр вируса в контроле составил 5,72±0,25 lg ИД₅₀ и 6,25±0,5 lg ИД₅₀ соответственно для ПМВ 1 и 2 серотипов; в концентрации 5 и 10 мкг/мл инфекционный титр вирусов снижался на 4,5-4,75 lg ИД₅₀; в концентрации 2,5 мкг/мл - на 3,75 lg ИД₅₀. Таким образом, изучение влияния гипорамина на репродукцию ПМВ птиц 1 и 2 серотипов в культуре клеток "Vero" в концентрации 2,5; 5 и 10 мкг/мл показало, что препарат оказывает вирусингибирующее и вируснейтрализующее действие на данной модели.

При изучении эффективности гипорамина на репродукцию ПМВ птиц серотипа 1 и 2 в системе куриного эмбриона для работы были использованы два штамма ПМВ птиц, имеющие наибольшую эпизоотологическую значимость; ПМВ-1 - вирус болезни Ньюкасла ("Бор") и ПМВ-2 - курица (Алма-Ата) 71/84, индюк Юкейпа/56. Вирус культивировали в 10-дневных куриных эмбрионах и на культуре клеток МДСК, "Vero", ФЭК. Вируснейтрализующее действие гипорамина на репродукцию ПМВ-1 и ПМВ-2 изучали в контактных опытах in vivo с индикацией на куриных эмбрионах. Изучение вируснейтрализующей активности гипорамина на репродукцию ПМВ-1 и ПМВ-2 показало, что препарат в концентрациях 10, 100 и 500 мкг/мл полностью нейтрализует репродукцию вируса в куриных эмбрионах (табл. 2).

При изучении химиотерапевтической эффективности гипорамина на модели парамиксовирусной инфекции кур для эксперимента использовали пятидневных цыплят по 10 особей для каждой группы. Препарат вводили перорально и внутрибрюшинно в дозах 50 мкг/особь и 300 мкг/особь в 0,2 мл пятикратно по схеме: за 24 ч и за 1 ч до инфицирования, а затем через 24, 48 и 72 ч после инфицирования. Для инфицирования цыплят использовали ПМВ-серотипа 1 - курица (Алма-Ата) 352/86 по 0,2 мл интраназально. Как видно из табл. 3, при введении гипорамина перорально и внутрибрюшинно наблюдалось защитное действие препарата. Падеж цыплят в опытной группе отмечался на 3-5-е сутки, а в контроле - на 2-3-е сутки. Причем введение препарата перорально предпочтительнее перед внутрибрюшинным. Проведенные эксперименты свидетельствуют, что гипорамин оказывает противовирусное действие на репродукцию ПМВ птиц серотипа 1 и 2 в культуре клеток, в системе куриного эмбриона и на модели парамиксовирусной инфекции кур.

Пример 5. При изучении антиаденовирусной активности гипорамина в работе использовали аденовирус человека типа 2 и перевиваемую линию клеток Нер-2. Антиаденовирусную активность гипорамина изучали методом, позволяющим определять количество инфицированных в препарате клеток по наличию в них характеристик внутриядерных включений. Гипорамин изучали в концентрациях 50, 25 , 10, 5, 2, 5 и 1 мкг/мл при нескольких способах обработки препаратом клеток и вируса:
- вирус контактировал и гипорамином в течение 1 ч при температуре 37^oC и использован для заражения клеток, адсорбция 1 ч при комнатной температуре, отмывка от неадсорбированного вируса, наличие препарата в соответствующей концентрации в поддерживающей среде после заражения (1 вариант);
- гипорамин добавлен к вирусу в соответствующей концентрации и смесь сразу использована для заражения клеток (адсорбция при комнатной температуре в течение 1 ч), после заражения препарат в среде отсутствовал (2 вариант);
- гипорамин присутствовал в поддерживающей среде после заражения (3 вариант);
- клетки контактировали с гипорамином в течение 1 ч до заражения (4 вариант).

Для определения вирусингибирующего эффекта использовали цитоморфологический метод, основанный на выявлении клеток, содержащих вирусные внутриядерные включения. Процент ингибирования гипорамином определяли по отношению к контролю. Для выявления вирулицидного действия гипорами, то есть его непосредственного деструктивного влияния на внеклеточный вирус, гипорамин в концентрации 10 мкг/мл добавляли к вируссодержащей жидкости, затем через 1, 2, 3, и 4 ч отбирали аликвоты, готовили 10-кратные разведения и заражали клетки с целью определения инфекционного титра вируса.

Установлено, что при проведении адсорбции вируса в присутствии гипорамина (варианты 1 и 2) выявлен его значительный вирусингибирующий эффект (табл. 4). При первом варианте обработки ингибирующий эффект гипорамин проявлял на высокой заражающей дозе вируса (91% инфицированных клеток в контроле); в концентрации 50 и 25 мкг/мл гипорамин полностью блокировал репродукцию аденовируса (ингибирование 100%), в концентрации 10 мкг/мл (в 25 раз меньше максимально переносимой) гипорамин уменьшал количество инфицированных клеток по отношению к контролю на 95%. В случае использования меньшей заражающей дозы вируса (при 53% инфицированных клеток в контроле) гипорамин полностью блокировал репродукцию аденовируса в концентрации даже 10 мкг/мл, а в концентрациях 5 и 1 мкг/мл уменьшал количество инфицированных клеток соответственно на 87 и 47%. При проведении адсорбции в присутствии гипорамина и использовании высокой множественности инфицирования (в контроле было 95% инфицированных клеток) также выявлен значительный ингибирующий эффект препарата. В данном случае в концентрации 5 мкг/мл гипорамин подавлял количество инфицированных клеток на 90%, в более высоких концентрациях - до 98% (вариант 2). Добавление гипорамина в среду после адсорбции вируса (вариант 3) не оказывало ингибирующего влияния на его репродукцию, количество инфицированных клеток не отличалось от контроля. При предобработке клеток гипорамином до заражения вирусом (вариант 4) незначительное подавление репродукции выявлено только в концентрации 50 мкг/мл. В более низких изученных дозах (25 и 10 мкг/мл) препарат не влиял на репродукцию аденовируса. Исходя из полученных данных можно было предположить, что гипорамин блокирует репродукцию аденовируса на первых этапах взаимодействия его с клеткой, происходящего в течение первого часа контакта с клеткой или обладает вирулицидным действием. При определении влияния гипорамина на внеклеточный вирус (табл. 5) установлено, что гипорамин не оказывает деструктивного действия на внеклеточный вирус, так как инфекционный титр его практически не снижался. Таким образом, использование вирусспецифического теста для оценки антиаденовирусной активности гипорамина позволило установить в культуре клеток выраженный ингибирующий эффект препарата. Вероятнее всего, гипорамин блокирует репродукцию аденовируса на первых этапах взаимодействия его с клеткой. Эффект наблюдался при наличии гипорамина в среде во время адсорбции вируса. Гипорамин обладает ингибирующим эффектом в концентрации в 50-10 раз меньше максимально переносимой (ХТИ= 50). Полагаем, что применение гипорамина в медицинской практике будет способствовать эффективности лечения вирусных заболеваний аденовирусной этиологии. Выявленный ингибирующий эффект препарата на первых этапах взаимодействия его с клеткой, возможно, позволит использовать препарат и с профилактической целью во время подъема заболеваемости, по эпидпоказаниям во время вспышек в ограниченных коллективах.

Пример 6. С целью изучения интерферониндуцирующей активности гипорамина использовали пробы цельной крови человека (100 мкл) и 800 мкл среды культивирования. Гипорамин вносили в дозах 10, 25, 50 и 100 мкл на миллилитр культуры клеток крови (100 мкл). Спустя сутки после культивирования отсасывали надосадочную жидкость с последующим титрованием в диплоидных клетках человека штамм М-19 с использованием плоскодонных 96-луночных плат. Время контакта надосадочной жидкости с клетками составило 24 ч при температуре 37^oC. По истечении этого срока к культурам добавляли индикаторный вирус энцефаломнокардита (ЕМС). Инфекционная доза составила 100 ТЦИД 50/0,1 мл. Титр интерферона определяли через 24 ч после инфицирования вирусом ЕМС. Активность выражали в международных единицах (МЕ). Параллельно с изучением интерферондуцирующей активности гипорамина проводилась индукция стандартными индукторами ВБН (вирус болезни Ньюкасла) и СЭА (стафилококковый энтодоксин типа A), продуцирующие α- интерферон и γ- интерферон, соответственно. В результате исследования интерферониндуцирующей активности установлено, что минимальные дозы гипорамина (10, 20 и 50 мкг/мл) способствовали синтезу более высоких титров интерферона (максимальные титры интерферона в надосадочной жидкости составили 65-80 МЕ/мл). Повышение концентрации гипорамина до 100 мкг/мл приводило к снижению продукции интерферона: при внесении высоких доз гипорамина получены минимальные титры интерферона (30 МЕ/мл).

При сравнительном изучении гипорамина по интерферониндуцирующей активности со стандартными индукторами интерферона ВБН и СЭА установлено, что гипорамин способствовал более высокой продукции интерферона по сравнению с использованием такого индуктора ,как СЭА (32 МЕ/мл), но уступал ВБН (256 МЕ/мл и выше). Таким образом, препарат гипорамин обладал низкой цитотоксичностью, является активным индуктором интерферона в культуре клеток периферической крови человека.

Изобретение относится к медицине и касается биологически активного средства противовирусного действия в отношении вирусов гриппа В, аденовирусов второго типа, парамиксовирусов первого и второго типов и других вирусов, патогенных для человека и животных, а также проявляет интерферониндуцирующие свойства. Средство представляет собой сумму полифенольных соединений из листьев облепихи крушиновидной, получаемое экстракцией водным органическим растворителем, например ацетоном, удалением органического растворителя, обработкой водного раствора двухкомпонентной смесью алифатического углеводорода с бутиловым спиртом, концентрированием водной фазы с последующим высушиванием водного концентрата. Изобретение расширяет арсенал противовирусных средств в отношении вышеперечисленных вирусов. 5 табл.

\\\1 Средство для лечения вирусных заболеваний, вызываемых вирусами гриппа B, парамиксовирусами первого и второго типов, аденовирусами второго типа, представляющее собой сумму полифенольных соединений из листьев облепихи крушиновидной, содержащее не менее 60% галлоэллаготаннинов, получаемое экстракцией водным органическим растворителем, например ацетоном, удалением органического растворителя, обработкой водного раствора двухкомпонентной смесью алифатического углеводорода с бутиловым спиртом, концентрированием водной фазы с последующим высушиванием водного концентрата.