КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ: ALCALIGENES DENITRIFICANS, PSEUDOMONAS MALTOPHILA, PSEUDOMONAS PUTIDA, PSEUDOMONAS SPECIES, BACILLUS SPECIES ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ПОЧВОГРУНТОВ, ВОД ОТ НЕФТИ, НЕФТЕПРОДУКТОВ И ОСТАТОЧНОЙ ЗАМАЗУЧЕННОСТИ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 C12R1/40 C12R1/05 C12R1/07 B09C101/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промпредприятий и других объектах.

Цель изобретения получение консорциума микроорганизмов деструкторов нефти для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяного загрязнения и остаточной замазученности.

Для достижения поставленной цели выделен из почвы, хронически загрязненных нефтепродуктами прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (Морской торговый порт Г. Владивостока), консорциум микроорганизмов - деструкторов: Alcaligenes denitrificans штамм KMM-НФ 2-4 (KMM-НФ коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов); Pseudomonas maltophila штамм КММ-НФ 2-10; Pseudomonas putida штамм КММ-НФ 2-1; Pseudomonas species штамм КММ-НФ 2 3; Bacillus species штамм КММ-НФ 2 8. Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов.

Выделенные штаммы микроорганизмов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера ВКМ В-2089Д; ВКМ В-2090Д; ВКМ В-2091Д; ВКМ В-2092Д; ВКМ В-2093Д соответственно.

Консорциум штаммов бактерий берут в количествах:
Alcaligenes denitrificans штаммы КММ-НФ 2-4 35%
Pseudomonas maltophila штамм КММ-НФ 2-10 17%
Pseudomonas putida штамм КММ-НФ 2-1 16%
Pseudomonas species штамм КММ-НФ 2-3 16%
Bacillus species штамм КММ-НФ 2-8 16%
Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ-НФ 2-4, ВКМ В-2089Д.

Морфолого-культуральные признаки. Одиночные, прямые палочки размером 1,0х2,0 мкм, подвижные, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие, полупрозрачные, выпуклые слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоавтотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин 80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, рафинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, pH 7,0 не патогенны.

Характеристика штамма Pseudomonas maltophila КММ-НФ 2-10, ВКМ В-2090Д.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки размером 0,5х1,5 мкм, подвижные, монотрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют желтые, гладкие, блестящие, слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоавтотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо и каталазоположительные. В специальных факторах роста не нуждается. Гидролизует крахмал, твин 80, желатин. Утилизирует глюкозу, целлобизу, γ -гистидин, g -аланин, g -пролин. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 32^oC, pH 7,2. Не патогенен.

Характеристика штамма Pseudomonas putida КММ-НФ 2-1, ВКМ В-2091Д. Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 0,8х3,0 мкм. Подвижны, монотрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют полупрозрачные колонии со слабо кремовым оттенком, слизистые, блестящие. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоавтотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. В специфических факторах роста не нуждаются. Клетки не продуцируют пигменты. Желатин, крахмал не гидролизуют. Утилизируют глюкозу, пропионат, глицерат, n бутанол, b -аланин, ДН-аргинин. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35^oC, pH 7,2. Не патогенен.

Характеристика штамма Pseudomonas species КММ-НФ 2-3, ВКМ В-2092Д.

Морфолого-культуральные признаки. Подвижные одиночные палочки размером 1,0х3,5 мкм. Грамотрицательные. На агаризованных питательных средах образуют беловатые, круглые, блестящие, слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические признаки. Хемоавтотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Пигментов не образуют. Желатин, крахмал не гидролизуют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, при 41^oC не растут, pH 7,0. Не патогенен.

Характеристика штамма Bacillus species КММ-НФ 2-8, ВКМ В-2093Д.

Морфолого-культуральные признаки. Крупные сдвоенные не подвижные палочки размером 1,2х4,0 мкм. Грамвариабельные, споры эллипсовидные, одиночные. На агаризованных средах формируют беловатые, округлые, слизистые колонии. Сапрофит.

Физиолого-биохимические свойства. Хемоавтотроф. Метаболизм дыхательный и бродильный. Оксидазо- и каталазоположительные. Крахмал, желатин, твин-80 гидролизуют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 30^oC, pH 7,0. Не патогенен.

Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде следующего состава, г/л: NH₄NO₃ 1,0 г K₂HPO 1,0 г, KH₂PO₄ 1,0 г. MgSO₄ 0,02 г, CaCl₂ 0,02, FeCl 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная 1000 мл, в качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта. Оптимальная температура роста 25 30^oC, pH 7,0 7,2 (Ворошилова, Дианова. Микробиология, т. 31, вып. 4. 1952).

Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: NH₄NO₃ 2,0 г, KH₂PO₄ - 10 г, вода дистиллированная 1000 мл, нефтепродукт 10 мл (Дядечко В.Н. Толстокорова Л.Е. Морозова Т.Н. А. с. N 1076446, 1984).

Среда состоящая из 0,3% водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17% способствует активному нарастанию биомассы консорциума.

Консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательную среду. Обычно выделенные штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов имеют невысокую активность и поэтому необходимо повысить их активность путем адаптации.

Адаптацию нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов в среде проводят путем частых пересевов на свежую питательную среду. Делают это для того, чтобы в питательной среде не происходило накопления токсических метаболитов микробного происхождения и, чтобы выявить более устойчивые особи нефтеокисляющих микроорганизмов, т. к. ослабленные клетки гибнут или плохо растут. Интенсивный рост дают только клетки физиологически активные. Таким образом проводят отбор активных клеток и получают консорциум.

Метод математического анализа установлено, что в данном консорциуме Alcaligenes denitrificans КММ-НФ 2-4 относится к наиболее часто встречаемому виду, т.е. к доминирующей форме (35%).

Микроорганизмы рода Pseudomonas, представленные видами Pseudomonas maltophila КММ-НФ 2-10, Pseudomonas species КММ-НФ 2 3, Pseudomonas pulida КММ-НФ 2-1 в целом также относятся к доминирующим видам в ассоциации (49% от числа всей популяции).

Бактерии рода Bacillus составляют 16% от общего числа микробной популяции, что позволяет их отнести к содоминантным видам, типично редки встречаемым.

Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению CO₂.

В колбы емкостью 500 мл, последовательно герметично соединенных, вносят поглотитель углекислоты BaOH. В колбу с инокулянтом вносят 250 мл среды Ворошиловой-Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,0х10 кл/мл. Подачу атмосферного воздуха проводят с помощью дозатора А-2 со скоростью 34 мл/мин. Для того, чтобы в колбу с инокулянтом не поступал CO₂ воздух предварительно проходит через 2 колбы с поглотителем CO₂ и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов аэрируемый воздух проходит через 2 колбы с поглотителем CO₂, далее BaOH оттитровывают HCl и определяют содержание выделенного углекислого газа, что и определяет окислительную способность консорциума. Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один с реактивами, без консорциума и нефтепродуктов, другой с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание CO не обнаружено.

Длительность опыта 30 суток. Окислительная активность консорциума составляет 1968 мг CO₂. Окислительная способность выпускаемого промышленностью микробиологического препарата "Путидойл", в состав которого входит штамм Pseudomonas putida 36 (Дядечко, Толстокорова, Морозова А.с. N 1076446, 1984) за 30 суток составляет 240,5 264,0 мг CO₂.

Таким образом, предлагаемый консорциум штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов обладает более высокой скоростью окисления нефтепродуктов.

Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве, размером 5х20 м, глубиной загрязнения 0,1 0,2 м с содержанием нефтепродуктов 19% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор и калий сбалансированы по 17% растворяют в 200 л воды. Загрязненный участок поливают водным раствором нитроаммофоски (1 л/м²) за два дня до вспашки. После вспашки через 2 дня вносят дополнительно водный раствор нитроаммофоски. Норма полива 1 л/м². Эта операция необходима для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,0х10¹² клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м². Через месяц содержание нефтепродукта в почве составляет 12% через 2 месяца 5% через 3,5 месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.

Таким образом, преимуществом предлагаемого консорциума штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты, что позволяет использовать его при биологической очистки почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами и остаточной замазученностью.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока. Консорциум содержит штаммы микроорганизмов-деструкторов Alcaligenes denitrificans, Pseudomonas maltophila, Pseudomonas putida, Pseudomonas species, Bacillus species для очистки почвы, почвогрунтов и вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.

Консорциум штаммов микроорганизмов деструкторов: Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2089Д, Pseudomonas maltophila ВКМ В-2090Д, Pseudomonas putida ВКМ В-2091Д, Pseudomonas species ВКМ В-2092Д, Bacillus species ВКМ В-2093Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.