Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промышленных предприятий и других объектах.
Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans, Bacillus species, Pseudomonas putida, Aeromonas species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности и выделенный из почв, загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Окислительная способность консорциума составляет 1981 мг CO2 за 30 суток (патент РФ N 2115629, кл. С 02 F 3/34, публ. 1998).
Недостатком консорциума является низкая окислительная способность.
Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Aeromonas species, Alcaligenes denitrificans, Arthrobacter species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности и выделенный из почв, загрязненных нефтепродуктами, прибрежной зоны юга Дальнего Востока. Окислительная способность консорциума составляет 2041 мг СО2 за 30 суток (патент РФ N 2127310, кл. С 12 N 1/20, публ. 1999).
Недостатком консорциума является низкая окислительная способность.
Задача изобретения - получение консорциума штаммов микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяного загрязнения и остаточной замазученности.
Для решения поставленной задачи выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (морской торговый порт г. Находки) консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-5 (КММ НФ - коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов), Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-6, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-16, Alcaligenes eutrophus КММ НФ 7-13, Pseudomonas maltophila КММ НФ 7-1.
Это природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов на почвенную биоту.
Выделенные штаммы микроорганизмов депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера ВКМ В-2070 D, ВКМ В-2071 D, ВКМ В-2072 D, ВКМ В-2074 D, ВКМ В-2073 D соответственно.
Штаммы микроорганизмов берут в следующих количествах: Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-5 - 22 %, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-6 - 23 %, Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-16 - 23%, Alcaligenes eutrophus КММ НФ 7-13 - 23%, Pseudomonas maltophila КММ НФ 7-1 - 9%.
Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-5.
Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 0,8 х 1,2 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, слизистые колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы.
Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин-80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-30oC, pH 7,0-7,5, непатогенен.
Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 7-16.
Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 0,8 х 1,5 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие не пигментированные колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, твин-80, желатин не гидролизуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют, способны окислять углеводороды нефти, температура роста 4-30oC, pH 7,0-7,5, непатогенен.
Характеристика штамма Alcaligenes eutrophus КММНФ 7-13.
Морфолого-культуральные признаки. Одиночные палочки размером 1,0 х 1,8 мкм, перетрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие блестящие, полупрозрачные, слизистые колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Крахмал, агар-агар, желатин не гидролизуют. Твин-80 гидролизуют. Арабинозу, рибозу, сорбозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-30oС, pH 7,0-7,5, непатогенен.
Характеристика штамма Pseudomonas maltophila КММ НФ 7-1.
Морфолого-культуральные признаки. Палочки размером 0,5 х 1,2 мкм, монотрихи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют слизистые, выпуклые, прозрачные колонии, сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Крахмал, твин-80, желатин гидролизуют. В специальных факторах роста не нуждаются. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4-37oC, pH 7,0-7,2, непатогенен.
Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде Ворошиловой - Диановой следующего состава, г/л: NH4NO3 - 1,0, K2HPO4 - 1,0, MgSO4 - 0,2, CaCl2 - 0,02, FeCl - 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная - 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта. Оптимальная температура роста 25-30oC, pH 7,0-7,2.
Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: K2HPO4 - 10,0, KH2PO4 - 1,0, NH4NO3 - 2,0, вода дистиллированная - 1000 мл, нефтепродукт - 10 мл.
Активному нарастанию биомассы консорциума способствует среда, состоящая из 0,3% водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%.
Заявленный консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательные среды. Чтобы повысить активность выделенных нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов, проводят их адаптацию путем частых пересевов на свежую питательную среду. Это позволяет выделить наиболее устойчивые, физиологически активные особи нефтеокисляющих микроорганизмов и получить активный консорциум штаммов микроорганизмов. Математически устанавливают, что в данном консорциуме микроорганизмы рода Alcaligenes составляют подавляющее большинство - 91 %.
Из них Alcaligenes denitrificans относится к типично доминирующим видам - 69%, a Alcaligenes eutrophus к типично часто встречаемым - 23%. Pseudomonas maltophila относится к случайным видам - 8%.
Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению СО2.
В колбы емкостью 500 мл, соединенные последовательно герметично, вносят поглотитель углекислоты BaOH. В колбу с инокулянтом вносят 250 мл среды Ворошиловой - Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,0 х 105 кл/мл. С помощью дозатора со скоростью 34 мл/мин подают атмосферный воздух. Для того чтобы в колбу с инокулянтом не поступал СО2, воздух пропускают через 2 колбы с поглотителем СО2 и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов аэрируемый воздух дополнительно проходит через две колбы с поглотителем СО2, затем BaOH оттитровывают HCl и определяют окислительную способность по количеству выделенного углекислого газа.
Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один - с реактивами без консорциума и нефтепродуктов, другой - с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание СО2 не обнаружено. Длительность опыта 30 суток. Окислительная способность консорциума составляет 2086 мг СО2.
Таким образом, предлагаемый консорциум штаммов микроорганизмов обладает высокой скоростью окисления нефтепродуктов.
Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве размером 20 х 4,0 м, глубиной загрязнения 0,1 - 0,2 м с содержанием нефтепродуктов 22% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%, растворяют в 200 л воды и поливают участок из расчета 1 л на 1 м2 за 2 дня до вспашки. После вспашки через 2 дня вновь вносят раствор на участок из расчета 1 л/м2. Это необходимо для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,0 х 1012 клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м2. Через месяц содержание нефтепродукта в почве составляет 10%, через 2 месяца - 4%, через 3 месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.
Преимуществом предлагаемого консорциума штаммов микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также высокая скорость окисления нефти и нефтепродуктов, что позволяет эффективно использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтепродуктами и остаточной замазученностью.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяных загрязнений. В состав консорциума входят штаммы Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2070D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2071D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2072D, Alcaligenes eutrophus ВКМ В-2074D и Pseudomonas maltophila ВКМ В-2073D. Консорциум выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами. Окислительная активность консорциума по конечному продукту окисления составляет 2086 мг СО2 за 30 суток. Преимущество консорциума заключается в способности расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты.
Консорциум штаммов микроорганизмов - деструкторов Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2070D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2071D, Alcaligenes denitrificans ВКМ В-2072D, Alcaligenes eutrophus ВКМ В-2074D и Pseudomonas maltophila ВКМ В-2073D, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.
