Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке нефтяного загрязнения почв, почвогрунтов и вод на территориях нефтебаз, нефтепромыслов, промпредприятий и других объектах.
Цель изобретения - получение консорциума микроорганизмов-деструкторов нефти для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяного загрязнения и остаточной замазученности.
Для достижения поставленной цели выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока (морской торговый порт г. Находка), консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans штамм КММ НФ 6 - 3 (КММ НФ - коллекция морских нефтеокисляющих микроорганизмов), Bacillus species штамм КММ НФ 6 - 4, Pseudomonas putida штамм КММ НФ 6 - 12, Aeromonas species штамм КММ НФ 6 - 7. Это - природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, которые сформировались в почве в результате длительного воздействия нефтепродуктов.
Выделенные штаммы микроорганизмов депанированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, где им присвоены номера ВКМ В - 2085Д, ВКМ В - 2086Д, ВКМ В - 2087Д, ВКМ В - 2088Д соответственно.
Консорциум штаммов микроорганизмов берут в количествах:
Alcaligenes denitrificans штамм КММ НФ 6 - 3 51%;
Bacillus species штамм КММ НФ 6 - 4 23%;
Pseudomonas putida штамм КММ НФ 6 - 12 13%;
Aeromonas species штамм КММ НФ 6 - 7 13%
Характеристика штамма Alcaligenes denitrificans КММ НФ 6 - 3.
Морфолого-культуральные признаки. Одиночные, прямые палочки размером 0,8 x 1,5 мкм, подвижные, перетрахи, грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, гладкие, полупрозрачные, выпуклые слизистые колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидазо- и каталазоположительные. Уреазу не образуют. Сорбозу, раффинозу, лактозу, меллибиозу, трегалозу не утилизируют. Крахмал, твин - 80, желатин не гидролизуют. Обладают очень высокой способностью окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35oC, pH 7,0 - 7,5 не патогенен.
Характеристика штамма Bacillus species КММ НФ 6 - 4.
Морфолого-культуральные признаки. Крупные, сдвоенные, подвижные палочки размером 1,2 x 2,2 мкм. Окраска по Граму - вариабельная. Споры элипсовидные, по одной в каждой клетке. Не агаризованных средах образуют круглые, грязно-белые, слизистые колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм и дыхательный, и бродильный. Оксидазо- и каталазоположительные. Крахмал, желатин, твин - 80 гидролизуют. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35oC, pH 7,0 - 7,5. Не патогенен.
Характеристика штамма Pseudomonas putida КММ НФ 6 - 12.
Морфолого-культуральные признаки. Одиночные прямые палочки размером 1,2 x 3,5 мкм. Подвижные, лофотрихи. Грамотрицательные. На агаризованных средах образуют круглые, выпуклые, блестящие, слизистые колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный. Оксидо- и каталазоположительные. Крахмал и желатин не гидролизуют. Утилизируют глюкозу, D-маннозу, α -арабинозу, D-фруктозу, пропионат, глицерат, n-бутанол, β -аланин, DL-аргонин. Клетки не продуцируют пигменты. В специфических факторах роста не нуждаются. Способность окислять углеводороды нефти высокая. Температура роста 4 - 37oC, pH 7,0 - 7,5. Не патогенен.
Характеристика штамма Aeromonas species КММ НФ 6 - 7.
Морфолого-культуральные признаки. Мелкие, подвижные палочки размером 0,5 х 1,0 мкм. Грамотрицательные. На агаризованных средах образуют растекающиеся, слизистые, полупрозрачные колонии. Сапрофит.
Физиолого-биохимические свойства. Хемоорганотрофы. Метаболизм и дыхательный, и бродильный. Оксидазо- и каталазоположительные. Гидролизуют желатин, крахмал. Газа на глюкозе не образуют. Люминесценцией не обладают. Способны окислять углеводороды нефти. Температура роста 4 - 35oC, pH 7,0 - 7,5. Не патогенен.
Предлагаемый консорциум микроорганизмов хорошо растет на жидкой среде следующего состава, г/л: NH4NO3 1,0 г, K2HPO4 1,0 г, KH2PO4 1,0 г, MgSO4 O,2 г, CaCl2 0,02 г, FeCl 2 капли концентрированного раствора, вода дистиллированная 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляют 10 мл нефтепродукта. Оптимальная температура роста 25 - 30oC, pH 7,0 - 7,2 (Ворошилова, Дианова. Микробиология, т. 31, вып. 4. 1952).
Интенсивный рост консорциума наблюдается при использовании среды следующего состава, г/л: K2HPO4 10,0, KH2PO4 1,0 г, NH4NO3 2,0 г, вода дистиллированная 1000 мл, нефтепродукт 10 мл (Дядечко, Толстокорова, Морозова. Авт. Св. N 1076446, 1984).
Среда состоящая из 0,3%-ного водного раствора нитроаммофоски, где азот, фосфор и калий сбалансированы по 17%, способствует активному нарастанию биомассы консорциума.
Консорциум был выделен из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, путем высева почвенного образца на агаризованную и жидкую питательную среду. Обычно выделенные штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов имеют невысокую активность и поэтому необходимо повысить их активность путем адаптации.
Адаптацию нефтеокисляющих микроорганизмов к повышенным концентрациям нефтепродуктов в среде проводят путем частых пересевов на свежую питательную среду. Делают это для того, чтобы в питательной среде не происходило накопление токсичных метаболитов микробного происхождения и чтобы выявить более устойчивые особи нефтеокисляющих микроорганизмов, так как ослабленные клетки гибли или плохо растут. Интенсивный рост дают только клетки физиологически активные. Таким образом проводят отбор активных клеток и получают консорциум.
Методом математического анализа установлено, что в данном консорциуме Alcaligenes denitrificans КММ НФ 6 - 3 относится к наиболее часто встречаемому виду, т. е. к доминирующей форме (51%), от всех изучаемых микроорганизмов в популяции. Бактерии Bacillus species КММ НФ 6 - 4 являются содоминантной культурой (23%). Pseudomonas putida КММ НФ 6 - 12 и Aeromonas species КММ НФ 6 - 7 редко встречаемые штаммы и составляют по 13% от общего числа нефтеокисляющих микроорганизмов.
Окислительную активность консорциума определяют по конечному продукту окисления, т.е. по выделению CO2.
В колбы емкостью 500 мл, последовательно герметично соединенных, вносят поглотитель углекислоты BAOH. В колбу с инокулянтом вносят 250 мл среды Ворошиловой - Диановой, 2,5 мл нефтепродукта и 5 мл трехсуточной культуры консорциума с содержанием 1,0 • 105 кл/мл. Подачу атмосферного воздуха проводят с помощью дозатора А - 2 со скоростью 34 мл/мин. Для того, чтобы к колбу с инокулянтом не поступал CO2, воздух предварительно проходит через 2 колбы с поглотителем CO2 и аэрация инокулянта проходит без углекислоты. После окисления нефтепродуктов аэрируемый воздух проходит дополнительно через 2 колбы с поглотителем CO2, далее BaOH оттитровывают HCl и определяют содержание выделанного углекислого газа, что и определяет окислительную способность консорциума. Для установления чистоты опыта одновременно ставят при таких же условиях еще 2 контроля. Один с реактивами без консорциума и нефтепродуктов, другой - с реактивами, нефтепродуктами, но без консорциума. В контроле содержание CO2 не обнаружено.
Длительность опыта 30 суток. Окислительная активность консорциума составляет 1981 мг CO2. Окислительная способность выпускаемого промышленностью микробиологического препарата "Путидойл", в состав которого входит штамм Pseudomonas putida 36 (Дядечко, Толстокорова, Морозова, Авт. св. N 1076446, 1984) за 30 суток составляет 240,0 x 264,0 мг CO2.
Таким образом предлагаемый консорциум штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов обладает более высокой скоростью окисления нефтепродуктов.
Применение консорциума. Для очистки нефтяного пятна на почве размером 4 x 25 м, глубиной загрязнения 0,1 - 0,2 м с содержанием нефтепродуктов 21% берут 0,7 кг минерального удобрения нитроаммофоски, в котором азот, фосфор и калий сбалансированы, по 17% растворяют в 200 л воды. Загрязненный участок поливают водным раствором нитроаммофоски (1 л/м2) за 2 дня до вспашки. После вспашки через 2 дня вносят дополнительно водный раствор нитроаммофоски. Норма полива 1 л/м2. Эта операция необходима для активизации как сапрофитной, так и аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры. Через неделю после внесения минеральных удобрений вносят инокулянт консорциума (водный раствор). Титр 1,0•1012 клеток в 1 мл. Норма полива 1 л/м2. Через месяц содержание нефтепродуктов в почве составляет 10%, через 2 месяца - 3%, через три месяца нефтепродуктов в почве не обнаружено.
Таким образом, преимуществом предлагаемого консорциума штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, а также с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты, что позволяет использовать его при биологической очистки почв, почвогрунтов и вод загрязненных нефтью, нефтепродуктами и остаточной замазученностью.
Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans, Bacillus species, Pseudomonas putida, Aeromonas species, предназначенный для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности, выделен из почв, загрязненных нефтепродуктами. прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока. Это - природные ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов. Окислительная способность консорциума составляет 1981 мг CO2 за 30 сут. Преимуществом консорциума штаммов микроорганизмов является способность расти на обедненной питательной среде, с высокой скоростью окислять нефть и нефтепродукты, что позволяет использовать его при биологической очистке почв, почвогрунтов и вод, загрязненных нефтью, нефтепродуктами и остаточной замазученностью.
Консорциум штаммов микроорганизмов - деструкторов: Alcaligenes denitrificans, ВКМ В - 2085 Д, Bacillus species ВКМ В - 2086 Д, Psendomonas putida ВКМ В - 2087 Д, Aeromonas species ВКМ В - 2088 Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.
| SU, авторское свидетельство, 1076446, C 02 F 3/34, 1984. |
