КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ Exiguobacterium mexicanum И Bacillus vallismortis ДЛЯ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12N1/26 B09C1/10 C12R1/07 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к экологической биотехнологии, микробиологии, и может быть использовано при очистке почвенных экосистем от нефтезагрязнений.

Сущность изобретения: создан консорциум микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений. Применение консорциума позволяет за два месяца осуществить деградацию нефтезагрязнения в мерзлотной почве в условиях сильнообводненной болотистой местности до 88,6%; в многолетнемерзлых грунтах в условиях равнинной местности - до 73,8%; в мерзлотно-таежной почве в условиях сильно залесенной местности - до 56,4%; в мерзлотных торфяниках - до 45,6% за тот же промежуток времени.

Аналоги изобретения

Известен биопрепарат «Путидойл» (1. Авторское свидетельство СССР №1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C02F 3/34, C02F 101/32, C12N 1/20, C12R 1/40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (2. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. - 1990, №9. - С. 148-151).

Недостатком данного штамма является то, что он растет и утилизирует нефть очень медленно и лишь при высокой температуре (28-42°С).

Известен биопрепарат "Бациспецин" (3. Авторское свидетельство SU №1743019. Штамм бактерий Bacillus sp. ВНИИСХМ №132 для получения препарата грибковых возбудителей болезней злаковых культур. С0, A01N 63/00, C12N 1/20. Заявка: 4767349/13, 03.10.1989. Опубликовано: 30.05.1994. Заявитель: Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР. Авторы: Мелентьев А.И., Усанов Н.Г., Логинов О.Н. Патентообладатель: ТОО "Новодекс"), используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Bacillus species 739 (4. Патент РФ №2077397. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, С09K 3/32, C12N 1/20. Заявка: 93029534/13, 15.06.1993. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Товарищество с ограниченной ответственностью "Новодекс", Андресон Роза Карамовна. Авторы: Андресон Р.К., Хазиев Ф.Х., Дешура B.C., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Новоселева Е.И. Патентообладатель: Товарищество с ограниченной ответственностью "Новодекс", Андресон Роза Карамовна).

Недостатком штамма является его низкая эффективность, особенно в условиях высокого содержания нефтезагрязнения.

Известен штамм Flavobacterium tirrennicum (5. Авторское свидетельство SU №1409594, 1988 г. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. A1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:20, C02F 3/34, C02F 101:32. Заявка: 4066152, 24.03.1986. Опубликовано: 15.07.1988. Заявитель: Институт микробиологии и вирусологии АН КАЗССР. Авторы: Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И.), который может разлагать углеводороды нефти. Недостатком штамма является то, что он осуществляет деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способен осуществлять очистку мерзлотной почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetronacter sp.НВ-1 (6. Патент RU №2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/01, C12N 1/20, В09С 101/00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии.); Acinetronacter sp. JN-2 (7. Патент RU №2064017. Штамм бактерий Acinetobacter species ВКПМ В-5971, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 93009595/13, 23.02.1993. Опубликовано: 20.07.1996. Заявители: Ушков С.Б., Ильинская Н. В. Авторы: Ушков С.Б., Ильинская Н. В. Патентообладатели: Ушков С.Б., Ильинская Н. В.); Pseudomonas alcaligenes Е7 (8. Патент RU №2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии) и Pseudomonas alcaligenes В-1 (9. Патент RU №2133770. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes В-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 98105709/13, 25.03.1998. Опубликовано: 27.07.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробиологии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробиологии). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (10. Патент RU 2193464. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1/01. Заявка: 2001130686/13, 14.11.2001. Опубликовано: 27.11.2002. Заявители: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть". Авторы: Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Патентообладатели: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть"). Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе, в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.

Нетрудоемким и наиболее близким к предлагаемому техническому решению, является «Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis» (11. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), согласно которому, для очистки почвы от нефтяных загрязнений вносят микробный препарат на основе суспензии штамма Bacillus subtilis «Колыма-7/2к». Применение такого микробного препарата позволяет за 3 месяца летнего периода снизить концентрацию нефти до 0,48%.

Одним из недостатков этого способа является неспособность входящего в микробный препарат штамма деградировать нефть в условиях широкого диапазона температур от +8 до +37°C.

Другим недостатком данного способа является то, что в состав микробного препарата входит только один штамм бактерий Bacillus subtilis «Колыма-7/2к», выращенный на мясопептонном агаре при pH 7,0-7,2, в течение 5 суток при температуре +37°C. Как известно биопрепараты, состоящие из двух и более штаммов микроорганизмов, более эффективно утилизируют нефтезагрязнения.

Решение поставленной задачи достигается путем внесения в нефтезагрязненные мерзлотные почвы консорциума микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений.

При использовании консорциума микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений устраняются все указанные недостатки применения при нефтяном загрязнении биопрепаратов на основе монокультур того или иного типа.

Основная особенность предлагаемого консорциума микроорганизмов состоит в том, что микроорганизмы, входящие в его состав, могут развиваться в широком диапазоне температур (от +8 до +37°C), что делает его перспективным для очистки почв, как в северных, так и в южных широтах.

Характеристика штаммов микроорганизмов, входящих в состав консорциума:

1) Штамм микроорганизмов Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

Штамм микроорганизмов Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан».

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11017.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки. Грамположительные споровые палочки, в мазках расположены одиночно и короткими цепочками.

На мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) с добавлением 1% глюкозы растет в виде сморщенных суховатых бежевых колоний через 1-3 суток колонии окрашиваются в коричневый цвет, субстрат не пигментирует.

На поверхности скошенного мясо-пептонного агара без добавления 1% глюкозы растет в виде сухой морщинистой пленки бежевого цвета.

На среде Сабуро (масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные колонии грязно-коричневого до болотно-коричневого оттенка крупные колонии диаметром до 1 см и более.

В мясопептонном бульоне (масс. %: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2), растет в виде морщинистой пленки бежевого цвета поверх бульона.

На минеральной среде Мюнца (12. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРО₄ - 0,14; KН₂РО₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде непрозрачных матовых серо-бежевых колоний, диаметром 0,1-0,2 см.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо растет при температуре от +8 до +37°C, в аэробных условиях. При температуре ниже +8°C и в анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста +30°C. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.

Штамм каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индолоотрицателен. Не образует сероводород. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета галактозидазу.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).

Условия хранения:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°C.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1.

2) Штамм микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан».

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции непатогенных промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11011.

Штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1. Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

Грамположительные палочки, размером 0,8-1,0 мкм. Подвижные. С перитрихиально расположенными жгутиками. В мазках располагаются скоплениями и попарно. Факультативные анаэробы. Спор и капсул не образуют.

На мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) формируют влажные, грязно-желтого цвета колонии округлой формы. Через 1-2 суток рельеф колоний изменяется. Колонии становятся суховатыми, края неровные.

На среде Сабуро (масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные колонии желтовато-оранжевого цвета, максимальный диаметр которых составляет 0,5 см.

В мясопептонном бульоне (масс. %: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2) вызывает диффузное промутнение.

На минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый кондентсат, бензин) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде непрозрачных матовых грязно-желтых колоний, диаметром 0,1-0,3 см.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +4 до +37°C, лучше в аэробных условиях. В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста +20 +30°C. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Штамм каталаза положителен, оксидаза отрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает многоатомные спирты. Слабо ферментирует глюкозу и сахарозу, другие углеводы не ферментирует. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индоло отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета галактозидазу.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичный (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или на минеральной среде с нефтью и нефтепродуктами или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при +4°C.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

Предлагаемый штамм Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 был выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан».

Культивирование штамма проводили в минеральной среде Мюнца следующего состава (г/дм³): KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7Н₂0 - 0,8; NaCl - 1,0; K₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³; pH среды - 7,2. Для чего 1,0 г нефтезагрязненной почвы с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +29±1°C. Рост бактерий наблюдали в течение 7 суток инкубации по образованию мутной беловатой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти. Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) с добавлением 1% глюкозы. Далее посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при +30°C. Через 48 часов, на поверхности ГРМ-агара появились суховатые бежевого оттенка колонии, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (13. Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408) идентифицирован, как штамм Bacillus vallismortis.

Изолированные колонии пересевали на скошенный мясопептонный агар. Через 48 часов инкубации при температуре +30°C, клетки штамма Bacillus vallismortis ВКПМ B-l1017 со скошенного агара использовали для определения активности в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

Пример 2. Выделение и культивирование штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выделен из нефтезагрязненной почвы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан».

Культивирование штамма проводили в минеральной среде Мюнца следующего состава (г/дм³): KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7H₂O - 0,8; NaCl - 1,0; K₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³; pH среды - 7,2. Для чего 1,0 г нефтезагрязненной почвы с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +29±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 7-10 дней инкубации по образованию мутной беловатой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти.

Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) с добавлением 1% глюкозы. Далее посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при +30°C. Через 48 часов на поверхности ГРМ-агара наблюдали появление грязно-желтых влажных колоний, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги, идентифицированы как штамм Exiguobacterium mexicanum.

Пример 3. Получение бактериальной суспензии на основе клеток штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 выращивают на мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) при температуре +30 +37°C в течение 2-х суток, затем смывают в 0,9% растворе NaCl в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/мл по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича. Полученную таким образом бактериальную суспензию используют для очистки почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов.

Пример 4. Получение бактериальной суспензии штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выращивают на мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) при температуре +30°C в течение 1-2-х суток, затем смывают в 0,9% растворе NaCl в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича. Полученную таким образом бактериальную суспензию штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 используют для очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов.

Пример 5. Определение нефтеокисляющей способности бактериальной суспензии штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

Бактериальную суспензию штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, полученную способом, описанным в примере 1, вносят в минерализованную водную среду (Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030), следующего состава (г/дм³): KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7H₂O - 0,8; NaCl - 1,0; K₂HPO₄ - 1,4; KH₂PO₄ - 0,6; вода дистиллированная 1,0 дм³, загрязненную нефтью или нефтепродуктами в количестве 1000 мг на 100,0 см³ среды и экспонируют при температурах +8°C;+20°C; +30°C и +37°C в качалочных условиях в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (14. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в минерализованной водной среде штамм Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 на 7-е сутки при температуре +8 +37°C утилизирует 18,59-52,82% - нефти; 25,46-82,26% - дизельного топлива; 28,19-50,04% - масла моторного; 56,40-84,73% - газового конденсата (таблица 1).

Пример 6. Определение нефтеокисляющей способности штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Бактериальную суспензию штамма Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011, полученную способом, описанным в примере 1, вносят в минерализованную водную среду следующего состава (г/дм³): KNO₃ - 4,0; MgSO₄·7H₂O - 0,8; NaCl - 1,0; K₂HPO₄ -1,4; KH₂PO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³, загрязненную нефтью или нефтепродуктами в количестве 1000 мг на 100,0 см³ субстрата и экспонируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025».

Данные эксперимента показывают, что в минерализованной водной среде штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 6,38-13,34% - нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C - 24,62-54,60%; при температуре +30°C - 51,9-69,25%; при температуре +37°C - 57,78-81,46%, в зависимости от типа ксенобиотика (таблица 2).

Пример 7. Составление консорциума микроорганизмов для очистки мерзлотных почв от нефтезагрязнений

В состав консорциума микроорганизмов для очистки мерзлотных почв от нефтезагрязнений входят микроорганизмы двух родов и двух видов: Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятые в консорциуме в соотношении 1:1. Для этого отдельно получают бактериальные суспензии на основе клеток штаммов бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 по примерам 3 и 4. Полученные бактериальные суспензии смешивают в соотношении 1:1, таким образом получают консорциум микроорганизмов, используемый для очистки мерзлотных почв от нефтезагрязнений.

Пример 8. Очистка различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений консорциумомом микроорганизмов

Эксперимент по очистке различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений с применением консорциума микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, выполнен в условиях открытой экосистемы на аварийной нефтезагрязненной территории нефтегазового комплекса Якутии.

Для опыта 1 литр консорциума микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, полученного способом, описанным в примере 7, вносили в почву, загрязненную нефтью. Почву тщательно перемешивали при помощи лопаты и экспонировали в течение двух месяцев. Площадь опытного участка с нефтезагрязненной почвой составила 1 кв.м.

Для анализа образцы почвы отбирали до начала эксперимента и после его окончания. Эффективность биодеградации нефти предлагаемым консорциумом микроорганизмов оценивали гравиметрическим методом (15. РД 39-0147098-90. Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома). Результаты исследований показывают, что предлагаемый консорциум микроорганизмов за два месяца осуществляет деградацию нефтезагрязнения в условиях сильнообводненной болотистой местности до 88,6%; в многолетнемерзлых грунтах - до 73,8%; в мерзлотно-таежной почве в условиях залесенной местности - до 56,4%; в мерзлотных торфяниках - до 45,6% за тот же промежуток времени (таблица 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого консорциума микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений является то, что микроорганизмы, входящие в состав консорциума обладают способностью утилизировать в жидкой минеральной среде как нефть, так и нефтепродукты в относительно короткие сроки (7 суток), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, что позволяет использовать штаммы для дальнейшего биотехнологического производства и очистки субстратов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Предлагаемый консорциум микроорганизмов может быть использован для реабилитации нефтезагрязненных территорий в условиях Крайнего Севера. Применение предлагаемого консорциума микроорганмзмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений позволяет производить эффективную очистку различных типов мерзлотных почв с различными ландшафтными характеристиками от нефтезагрязнений. Результаты исследований показывают, что предлагаемый консорциум микроорганизмов за два месяца осуществляет деградацию нефтезагрязнения в условиях сильнообводненной болотистой местности до 88,6%; в многолетнемерзлых грунтах в условиях равнинной местности - до 73,8%; в мерзлотно-таежной почве в условиях сильно залесенной местности - до 56,4%; в мерзлотных торфяниках - до 45,6% за тот же промежуток времени.

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к экологической биотехнологии, микробиологии. Предложен консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений. Консорциум обладает способностью утилизировать нефть и нефтепродукты в относительно короткие сроки в широком диапазоне температур от +8 до +37°C. 3 табл., 8 пр.

Консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений.