ПАСТЕРЕЛЛЕЗНЫЙ АНТИТЕЛЬНЫЙ ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ ДИАГНОСТИКУМ И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/556 A61K39/102 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть в качестве серологического метода идентификации бактерий Pasteurella multocida - возбудителя пастереллеза сельскохозяйственных животных.

Пастерелла - широко распространенное заболевание многих видов животных и птиц, протекает в виде эпизоотий, наносящих большой экономический ущерб сельскому хозяйству. В цепи мероприятий по борьбы с пастереллезом важным звеном является постановка своевременного и точного диагноза заболевания. Этой цели помимо бактериологического анализа может служить серологический метод, позволяющий быстро идентифицировать возбудителя, выделенного от павших или больных животных.

Актуальность выполненной работы обусловлена отсутствием в России производства специфических диагностических препаратов, пригодных для быстрого обнаружения возбудителя пастереллеза.

Задача изобретения - разработка пастереллезного антительного эритроцитарного диагностикума, способного выявлять клетки P.multocida любого из трех серотипов (A, B, D) ж этого микроорганизма.

Решение задачи достигается тем, что предлагается диагностикум, включающий носитель и сенситин, причем в качестве носителя он содержит стабилизированные бараньи эритроциты, а в качестве сенситина - пастереллеазную сыворотку к капсульному антигену, выделенному из клеток эпизоотического штамма P.multocida IN 576.

Диагностикум получают сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов барана кроличьей пастереллеазной сывороткой в присутствии 0,5% CrCl₂ при 18 - 20^oC в 0,85% раствора NaCl, в течение 5 мин.

Пример 1. Способ приготовления предлагаемого диагностикума
A. Получение капсульного антитела P.multocida.

Клетки штамма P.multocida JN 576 выращивают на матрасах с мясопептонным агаром (МПА) в течение 12 - 13 ч при 37^oC. Биомассу смывают 0,02 M Na-фосфатным буфером pH 7,0. Клетки осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 мин. К супернатанту добавляют (NH₄)₂SO₄ до 80% насыщения, выдерживают в течение 16 - 18 ч при +4^oC, после чего центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Осадок перерастворяют в 0,02M Na-фосфатном буфере pH 7,0, диализуют против этого же буфера в течение 16 - 18 ч и используют в качестве антигена для иммунизации животных.

Б. Иммунизация кроликов и получение пастереллезной сыворотки.

Смесь антигена в количестве 200 мкг с неполным адъювантом Фрейда в соотношении 1 : 1 вводят кроликам подкожно между лопаток. Инъекции повторяют четыре раза с интервалом в одну неделю. Через 7 дней после заключительной иммунизации из ушной вены отбирают кровь и получают из нее сыворотку, содержащую антитела к капсульному антигену P. multocida в титре 1/16-1/32 согласно данным реакции диффузионной преципитации.

B. Сенсибилизация формалинизированных бараньих эритроцитов сывороткой, полученной к капсульному антигену.

Смешивают 1 объем 50% взвеси эритроцитов, 1,5 объема нативной иммунной сыворотки и четыре объема 0,5% раствора CrCl₃ в 0,85% NaCl. Смесь выдерживают 5 мин при 18 - 20^oC. Затем реакцию останавливают быстрым охлаждением, после чего эритроциты трижды отмывают 0,85% NaCl, pH 7,2, содержащим 0,5% нормальной лошадиной сыворотки. Осадок отмытых сенсибилизированных эритроцитов суспендируют в 0,85% NaCL, pH 7,2 до 2,5% концентрации, добавляют формальдегид до 0,03%.

Полученный таким образом эритроцитарный антительный диагностикум применяют для идентификации бактерий P.multocida серотипов A, B и D, выделенных от больных и павших животных. С этой целью используют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА).

Пример 2. Оценка эффективности эритроцитарного антительного пастереллезного диагностикума.

Кровь больных или суспензию из органов (печень, селезенка, легкие, сердце) павших животных высевают на агаровые среды, содержащие 3 - 5% цельной крови, и инкубируют при 37^oC в течение 18 - 20 ч. Полученные колонии микроорганизмов суспендируют в 0,85% NaCl и используют для тестирования в РПГА.

Для проведения РПГА применяют полистироловые пластины с вместимостью лунок 0,2 мл и микротитратор типа "Такачи".

В 12 лунок микротитровальных пластин пипеткой вносят по 2 капли (0,05 мл) твина 80 в разведении 1:50000. Затем в первую лунку добавляют 0,05 мл исследуемой микробной взвеси и делают двухкратные последовательные разведения переносим по 0,05 мл (петлей с большой головкой) во все лунки кроме последней. Петли после использования обжигают и охлаждают. Затем во все лунки добавляют по 0,025 мл диагностикума эритроцитарного пастереллезного антительного 0,6% концентрации и оставляют пластины на 2,5±0,5 ч при температуре 22±4^oC, после чего учитывают предварительный результат. Окончательный учет результатов производят через 24 ч. При наличии в исследуемой микробной взвеси клеток P.multocida эритроциты образуют на дне лунок равномерный осадок в виде "зонтика" и результат реакции считывается положительным. В отрицательном случае эритроциты оседают в виде "пуговиц". Последняя (двенадцатая) лунка играет роль отрицательного контроля.

Полученный диагностикум обладает высокой чувствительностью. Минимальная концентрация клеток P. multocida, выявляемая с его помощью составляет 10⁶ кл/мл.

Пример 3. Проверка пастереллезного антительного эритроцитарного диагностикума на специфичность в РПГА.

Для использования в РПГА тестируемые микроорганизмы выращивают на плотных питательных средах (МПА, агар Хоттингера) при 37^oC в течение 18-20 ч. Полученные культуры микробов суспендируют в 0,85% NaCl и исследуют в РПГА. Результаты анализа специфичности предлагаемого диагностикума в отношении близкородственных микроорганизмов в РПГА представлены в таблице.

Отсутствие перекрестных реакций при проверке в РПГА с клетками E.coli, Sal. minnesota, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis свидетельствуют о высокой специфичности полученного диагностикума.

Использование: в биотехнологии, ветеринарной микробиологии, диагностическом препарате, серодиагностике пастереллеза, пастереллезном антительном эритроцитном способе его получения. Сущность изобретения: диагностикум в качестве носителя содержит стабилизированные бараньи эритроциты, а в качестве сенситина - пастереллезную сыворотку к капсульному антигену, выделенному из клеток эризоотического штамма Pasteurella multocida. Диагностикум получают сенсибилизацией формализированных эритроцитов барана кроличьей пастереллезной сывороткой в присутствии 0,5% хлористого хрома при температуре 18 - 20^oC в 0,85% растворе хлористого натрия, в течение 5 мин. Диагностикум способен выявлять клетки P. multocida любого из трех серотипов (А, В, Д), этого микроорганизма, 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

1. Пастереллезный антительный эритроцитарный диагностикум, содержащий носитель и сенситин, отличающийся тем, что в качестве сенситина содержит пастереллезную сыворотку к капсульному антигену, выделенному из клеток эпизоотического штамма Pastcurella multocida JN 576. 2. Способ приготовления пастереллезного антительного эритроцитарного диагностикума путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов пастереллезной сывороткой, отличающийся тем, что используют пастереллезную сыворотку к капсульному антигену, выделенному из клеток эпизоотического штамма Pasteurella multocida JN 576.