Способ дифференциации иерсиний серовара 09 от бруцелл Советский патент 1992 года по МПК A61K39/10 A61B10/00 G01N33/554 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к методам лабораторной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза, а именно к методам дифференциации иерсиниоза 09 и бруцеллеза путем выявления специфических антител в сыворотке крови.

Выраженная антигенная общность возбудителя иерсиниоза серовара 09 с бруцеллами обуславливает появление в крови у больных перекрестно реагирующих антител, которые в высоких титрах обнаруживаются в общепринятых серологических реакциях (реакции пассивной (РПГА), Райта, Хеддлсона и др.) как с иерсиниозным 04, так и с бруцеллезным коммерческими диагностикумами, что затрудняет дифференциальную диагностику этих зоонозных заболеваний. Общность симптоматики ряда клинических форм, источников инфекции и факторов передачи при иерсиниозе и бруцеллезе создают дополнительные трудности в эпидемиологической оценке отдельных случаев и вспышек заболеваний, особенно в благополучных по бруцеллезу районах. Это, в свою очередь, может привести к гипердиагностике бруцеллеза и повлечь за собой необоснованные клини- ко-эпидемиологические мероприятия.

Известен способ серологической дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза в реакции агглютинации с исжА

пользованием ОН-аптигепо иерсиний серо- одрз 09.

Однако данный способ весьма трудоемок, так как для получения ОН-антигена иерсинпй пассируют в полужидком питательном агаре при 23°С в течение 7 дней, а затем 2 сут - в бульоне (для накопления подвижных форм) и дополнительно 2 сут обрабатывают формалином с последующей стандартизацией микробной массы и постановкой-развернутой реакции Н-агглютина- Јои с прогреванием при 56°С в течение получаса. Кроме того, не учитывается роль отдельных связанных с вирулентностью ан- .тигенов иерсиний в патогенезе иерсиниоза. . Согласно наиболее близкому к предла- гаемому способу сыворотку, дающую положительную реакцию агглютинации с мерсиниозным и бруцелезным диагностику- мами, абсорбируют лиофилизированным препаратом фенольной фракции из штамма бруцелл и повторно ставят реакцию агглютинации с теми же диагнсстикумами. При диагональном снижении титров о отношении бруцеллезного.диагностилина исследуемую сыворотку считают иерсиниозной, в отношении обоих диагностикумов - бруцеллезной. . .

Недостатком известного способа является необходимость фракционирования бруцелл, а также многоэтапность диагностики с применением абсорбции антитея и постановкой развернутой реакции агглютинации.: .-

Целью изобретения является повышение точности м упрощение способа.

Цель достигается тем, что для выявления антител к специфическим антигенам вирулентных иерсиний исследуемую сыворотку, дающую о диагностически значимых титрах положительные реакции с бруцеллезным и иерсиниозным коммерческими диагностикумами, в разведении 1:20 , используют для реакций агглютинации на стекле с микробной суспензией кишечных иерсиний серовара 03 с плазмидой 40-50 мегэдальтон (штамма Yersinla cntrocolitica 188), выращенного при 37°С (Л) и его бесплазмидным мутантом штамм № 189, ны- рзщённым в тех же условиях (П . При появлении о течение 2 мин агглютинации только плазмидосодержэщих клеток дидгносциру- ют ийрсиниоз; при отсутствии агглютинации обеих культур - бруцеллез.

Биологические свойства штамма Yersinla entercolitica N: 188, Штамм № 188 относится к ибнаваруГОЗ се.ротипу.

Морфологические признаки; на мясо- котонмом бульоне при 26°С образует пллоч- ковидкые грамотрицательпые клетки

размером 0,5-0,8x1,0-1,5 мш. при 37°С неподвижен, спор и капсул не образует. Физиологические призмак и: растет на агаре Хогшнгера, На срезе Эндо при 2б°С через

24 ч образует колонии диаметром 0,1-0,2. мм, имеет вид росинок, через 48 ч приобретает розовый оттенок, диаметр 1,0-1,5 мм, при 37°С через 24 ч образует округлые колонии диаметром 0,05-0,1. мм, через 48 ч 0 0,3-0,5 мм, выпуклые розовые полупрозрачные, иногда с неровными краями. Штамм обладает культуральными признаками содержания плазмиды вирулентности: температурозависимостыо роста на каль5 ций-дефицитных средах, оггмотинобель- ностью (при культивировании в среде кларка). Характерные физиологические особенности: оксидазоотрицателен, .обладает, нитротрадуктазой, гидролизует мочевину,

0 сбраживзет глюкозу, сахарозу, сорбит, мальтозу, маннит, трегальзу с образовани- . ем кислоты, не сбраживает кантозу, ремно- зу, рафинозу, инозит, салицин, каллезу, не дезоминирует фенилаланин, не образует

5 инзол и сероводород нафазеОлькецицкого. Устойчив к стрептомицину, канамицину; чувствителен.к тетрациклину, гентамицину, левомицетину, рифамицину.

Содержит неконъюгативную плазмиду

0 маской 45-47 МД, относящуюся к группе несовместимости F-1, Гены ллзЗмиды контролируют патогенные свойства штамма. Штамм 188 обладает признаками патоген- ности при тестировании путем заражения

5 культуры ткани Нёр-2 (знтерэльно), морских свинок (конъюнктивзльно).

Биологические свойства, штамма (коллекция ГИ.СК им. Л.А.Тарасевича): штамм 189 является бесплазмидным мутантом

0. штамма № 188, утратившим плазмизу 45-47 МД, и все связанные с ней признаки: кальций-зависимость роста, способность к ауто- агглютинации, температурозависимую морфологию колоний, способность синтёзи5 ровзть плазмизоспецифичные антигены, вызывать конъюнктивит у морских свинок, колонизацию кишечника мышей, высокуюин- фекциозность в отношения клеток культуры ткани. Остальные свойства идентичны исход0 ному штамму Yersinla enterocolitica Nb 188. При м е р 1. У болмюго В. с подозрением на обострение хронического бруцеллеза сыворотка крови испытана о серологических реакциях со следующими результатами: реакция

5 агглютинации (Райта) с единым-бруцеллезным диагностикумом положительна в титре 1:800, РПГА с бруцулезным эритроцитарным дня гностику мом положительна в титре 1:800. РПГА с-кищечно-иерспниозным диагностикумом 09 положительная о титре

1:640. Сыворотка крови больного разведена в физиологическом растворе до 1:15 и в виде двух капель нанесена на предметное стекло рядом с двумя небольшими каплями ФР. Выращенные на скошенном агаре Хоттин- гера (сутки при 36°С и сутки при комнатной температуре) культуры иерсинкй серовара 03, содержащих (П4) и несодержзщих (П) плазмиду 45-47 МД (штамма 188 и 189 соответственно), с помощью петли суспензиро- ваны в капле физиологического раствора и .смещены: каждая с испытуемой сывороткой и с физиологическим раствором. В течение 2 мин при покачивании стекла агглютинация не отмечена ни в одной из четырех ка- пель. Диагноз хронического бруцеллеза подтвержден, иерсиниоза исключен.

П р и м е р 2. В сыворотке крови коровы из совхоза К. при профилактическом обследовании обнаружены антитела к бруцеллам: реакция Райта положительна в титре 1:100- 1:200 РПГА с кишечно-иерсиниозным диаг- ностикумом 09 положительная в титре 1:640. С целью дифференциальной серологической диагностики, сыворотка рззведе- на. в физиологическом растворе до 1:25 и в виде днух капель нанесена на стекло рядом С двумя каплями заведомо отрицательной (на иерсиниозкые антитела) сывороткой в том же разведении. После суспензирования в физиологическом растворе выращенных на питательном агаре при 38°С и комнатной температуре культур иерсиний серовара 03 (П и П) каждую из них смешивают с контрольной и испытуемой сывороткой. В тече- ние 40-60 с появляется агглютинация культуры 03 П+ в испытуемой сыворотке, в других каплях в течение 2 мин остается равномерное помутнение. В сыворотке выявлены антитела к плазмидоспецифичным гантигензм иерсиний, подтвержден диагноз иерсиниоза 09. , ,:

П р и м е р 3. После иммунизации кро- лика вакциной из штаммов Br. abortus и Вг. melltensis на девятый день у него взяли

кровь и отделили сыворотку, в которой выявлены антитела к бруцеллам (РПГА с бруцеллезным диагностикумом положительна в титре 1:25600) и иерсинйям 09 (РПГА .с кишечно-иерсиниозным диагностикумом 09 положительна в титре 1:5120), В реакции агглютинации на стекле установлено, что испытуемая сыворотка в разведении 1:20 не агглютинирует в течение 2 мин клетки иерсиний серовара 03 (штаммы 188 и 189). выращенных на агаре Хоттингера сутки при 37°С и сутки при комнатной температуре. Таким образом, показано отсутствие в крови экспериментально вакцинированного бруцеллами животного антител к характерным для плазмидосодержащих иерсиний антигенам.,

Таким образом, предложенный способ упрощает серологическую дифференциацию бруцеллеза от иерсиниоза. Использование для реакции в качестве антигена микробных клеток изогенной пары иерсиний, отличающихся только по контролируемым плазмидой антигенам, позволяет повысить ее-специфичность.

Формула изобретения Споеоб дифференциации иерсиний серовара 09 от бруцелл, включающий смешивание исследуемой сыворотки параллельно с двумя корпускулярными антигенами и дифференциацию иерсиниоза по наличию агглютинации, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, исследуемую сыворотку разводят 1:15-1:25, в качестве корпускулярных антигенов используют штамм Yerslnla enterocolitlca ГИСК № 188, содержащий плазмиду вирулентности с мол. м. 40-50 МД, и штамм Yersinla enterocolitlca ГИСК Ne 189, не содержащий плазмиды вирулентности, выращенные, при 36-38°С, дифференциацию иерсиниозз проводят по наличию агглютинации со tuTaMMOMj/erslnJa entrocotitlca ГИСК № 183.

Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза 09 и бруцеллеза относится к способам лабораторной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза путем выявления в сыворотке крови специфических антител к антигенам возбудителя. Цель изобретения повышение точности и упрощение способа. Для этого проводят целенаправленный поиск антител к антигенам, специфичным для иерсиний, содержащих плазмиду вирулентности с мол. м. 40-50 МД. В качестве антигена используют клетки иерсиний серовара 03, не имеющие перекрестно реагирующих антигенов с бруцеллами, но содержащих, как и возбудитель иерсиниоза 09, плазмиду и соответствующие идентичные антигены. Ставят реакцию агглютинации на стекле с разведенной 1:15-1:25 перекрестно реагирующей сывороткой и клетками иерсиний серовара 03, содержащими и несодержащими плазмиду вирулентности 40-50 МД, выращенными при 36-38°С. Если в течение 2 мин наступает агглютинация только плазми- досодержащих клеток, диагносцируют иер- синиоз; при отсутствии агглютинации обеих культур диагносцируют бруцеллез. ел