ШТАММ В/60/ПЕТЕРБУРГ/95/20 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЕТЕЙ Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 C12N7/00 C12R1/91 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма B/60/Петербург/95/20. Известный вакцинный штамм B/60/32/P вируса гриппа B - прототип [1] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызывать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной современными штаммами вируса гриппа B.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса B/Петербург/92/95.

Вакцинный штамм B/60/Петербург/95/20 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса B/Петербург/92/95 с холодоадаптированным штаммом B/СССР/60/69 - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу B/СССР/60/69. Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [2].

Методом сравнительного анализа электрофоретической подвижности фрагментов РНК родительских вирусов и реассортантных клонов в полиакриламидных гелях установлено, что вакцинный штамм B/60/Петербург/95/20 унаследовал 6 генов, кодирующих внутренние белки (PB1, PB2, PA, NP, М, NS) от донора аттенуации, и 2 гена, кодирующих поверхностные белки - HA (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу) - от эпидемического вируса. Штамм является температурочувствительным (разность титров при 33^oC и 39^oC - 6.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33^oC и 25^oC - 4,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Таким образом, представленный вакцинный штамм B/60/Петербург/95/20 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса B/Петербург/92/95, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33^oC в течение 72 часов - 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность -1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Данные из паспорта на вакцинный штамм B/60/Петербург/95/20 приведены ниже.

1. Название штамма - B/60/Петербург/95/20
2. Серия - серия 1
3. Метод получения и характеристика родительских вирусов при представлении рекомбинантного штамма: рекомбинация
а). эпидемический вирус - B/Петербург/92/95
б). донор аттенуации - B/СССР/60/69
4. Количество пассажей - 7 в процессе рекомбинации
5. Характеристика штамма:
а). оптимальные условия репродукции - 33^oC, 72 часа;
б). гемагглютинирующая активность - 1:256;
в). инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
г). чувствительность к ингибиторам - ингибиторочувствительный;
д). разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 39^oC - 6.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл:
е). разность в показателях инфекционной активности при 33^oC и 25^oC - 4.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

ж). структура генома рекомбинанта:
- гены от эпидемического вируса- НА, NA
- гены от донора аттенуации - РА, РВ1, РВ2, NP, М, NS
6. Характеристика штамма после лиофилизации:
а). дата лиофилизации - 8 июля 1996 года:
б). объем материала в ампуле - 1 мл;
в). количество доз в серии - 3;
г). инфекционная активность - 7.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл;
д). гемагглютинирующая активность -1:128.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:3.

8. Антигенная специфичность
а). гемагглютинина в РТГА - идентичен вирусу В/Петербург/92/95, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется;
б). нейраминидазы - идентична вирусу В/Петербург/92/95 по данным электрофореза в полиакриламидном геле.

9. Безвредность для мышей при подкожном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 26 июля 1996 года
результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

1. Штамм B/60/Петербург/95/20 ареактогенен и иммуногенен для взрослого контингента.

Пример 1. При вакцинации 72 взрослых лиц интраназально рекомбинантным вакцинным штаммом B/60/Петербург/95/20 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5^oC не наблюдалось. Средние реакции с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5^oC наблюдались в 1,4%. Слабые температурные реакции (до 37,5^oC) наблюдались в 1,4% случаев. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%. Результаты обследования приведены в таблице 1.

В группе из 77 лиц, получивших плацебо, средние температурные реакции отмечались в 6,5%, слабые реакции также наблюдались в 6,5% случаев.

При изучении в реакции РТГА сывороток крови 47 серонегативных вакцинированных лиц был обнаружен 4-кратный и более прирост сывороточных антител к эпидемическому штамму B/60/Петербург/95/20 в 63,8% случаев. Средние геометрические титры антител во вторых сыворотках у лиц с 4-кратным и более приростами антител составили 1:30,3.

Таким образом, вакцинный штамм B/60/Петербург/95/20 по показателям реактогенности и иммуногенности соответствует требованиям, предъявляемым фармакопейной статьей ФС 42-299 ВС-89 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых.

2. Штамм В/60/Петербург/95/20 ареактогенен при интраназальном введении детям 3-14 лет.

Пример 2. Группу из 103 детей в возрасте 3-14 лет, вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл рекомбинантным вакцинным штаммом B/60/Петербург/95/20 с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1: 2. Группа детей того же возраста из 89 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 2.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5^oC не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5^oC также не наблюдались. Показатель реактогенности составил 0%. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5^oC - в 3,9% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5^oC не наблюдались. Средние температурные реакции отмечались в 1,1%, а слабые - в 3,4% случаев.

Таким образом, вакцинный штамм B/60/Петербург/95/20 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам фармакопейной статьей ФС 42-298 ВС-89 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения детям 3-14 лет.

ЛИТЕРАТУРА
1. Штамм B/60/32/P вируса гриппа B, используемый для получения живой интраназальной вакцины для взрослых и детей. Авторское свидетельство N1731811, опубликован 07.05.92 БИ N17 за 1992 г.

2. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. -1994. -151 с.

Изобретение предназначено для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых людей и детей, соответствующей по антигенным свойствам актуальному вирусу В/Петербург/92/95. Вакцинный штамм В/6О/Петербург/95/20 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Петербург/92/95 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации. Штамм безвредный для взрослых и детей. Его свойства дают возможность гарантированно получать реассортантные вакцинные штаммы из вновь появляющихся эпидемических вирусов. Штамм В/6О/Петербург/95/20 активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32-33^oС. Характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм В/6О/Петербург/95/20 ареактогенен для взрослых и детей 3-14 лет при интраназальном введении и удовлетворяет показателям иммуногенности. Вакцинный штамм В/6О/Петербург/95/20 по биологическим свойствам и показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам фармакопейной статьей ФС 42-298 ВС-89 и ФС 42-299 ВС-89 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения детям 3 - 14 лет и живую гриппозную вакцину для интраназального применения для взрослых. 2 табл.

Штамм вируса гриппа И/60/Петербург/95/20 ГИСК N 1003 (Государственный институт стандартизации и контроля им.Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей.