ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/ ИОХАННЕСБУРГ/99/50 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ Российский патент 2003 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназально гриппозной вакциной из штамма В/60/Иоханнесбург/99/50.

Известен вакцинный штамм В/60/Петербург/95/20 вируса гриппа В - прототип [1] . Он обладает необходимой генной характеристикой 6:2 и используется в производстве живой тривалентной вакцины для взрослых и детей. Однако он утратил антигенную актуальность. Вследствие этого штамм не может вызывать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной современными штаммами вируса гриппа В.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение нового вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Иоханнесбург/05/99. Вакцинный штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса штамма В/Иоханнесбург/05/99 с холодоадаптированным штаммом В/СССР/60/69 - донором аттенуации с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу В/СССР/60/69. Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [2, 3] . Полученные реассортантные штаммы должны унаследовать 6 генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации, что обеспечивает их безвредность. 2 гена, кодирующих поверхностные белки - НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу), должны быть унаследованы от нового эпидемически актуального вируса.

Определение состава генома вакцинного штамма осуществляли с помощью сравнительного анализа электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов вирионных РНК реассортантных клонов и родительских вирусов в 2,8% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 4,5 Мол мочевины. Вертикальный электрофорез проводили при постоянном напряжении 100 V в течение 20 часов, 4^oС. Гель снимали со стекла, отмывали от мочевины и окрашивали азотнокислым серебром по общепринятой методике [4]. Показано, что все внутренние гены реассортанта В/60/Иоханнесбург/99/50 унаследованы от донора аттенуации В/СССР/60/69, а гены, кодирующие негликозилированные белки - гемагглютинин и нейраминидазу, - от эпидемического вируса В/Иоханнесбург/05/99. Принадлежность гемагглютинина и нейраминидазы родительскому штамму В/Иоханнесбург/05/99 также подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА). Штамм является температурочувствительным (разность титров при 33 и 39^oС - 6,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33 и 25^oС - 4,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Таким образом, представленный вакцинный штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса В/Иоханнесбург/05/99, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Штамм депонирован в коллекции Государственного Института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов под 398/9.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33^oС в течение 72 часов - 6,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:64
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Паспорт на вакцинный штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 прилагается.

1. Штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 ареактогенен и иммуногенен для взрослого контингента, что проверено на волонтерах, показатель реактогенности - 0%.

Пример 1. При вакцинации 56 взрослых лиц интраназально рекомбинантным вакцинным штаммом В/60/Иоханнесбург/99/50 с инфекционной активностью 6,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5^oС и средних реакций с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5^oС не наблюдалось. Показатель реактогенности составил 0%. Слабые температурные реакции (до 37,5^oС) наблюдались в 5,4% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 1.

В группе из 51 человека, получивших плацебо, слабые температурные реакции наблюдались в 5,9% случаев.

При изучении в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) сывороток крови 37 серонегативных вакцинированных лиц был обнаружен 4-кратный и более прирост сывороточных антител к эпидемическому штамму В/6О/Иоханнесбург/05/99 в 40,5% случаев. Средние геометрические титры антител во вторых сыворотках у лиц с 4-кратным и более приростами антител составили 1:15 (Табл.2).

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 по показателям реактогенности и иммуногенности соответствует требованиям, предъявляемым фармакопейной статьей ФС 42-299 ВС-89 к вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины для интраназального применения для взрослых.

2. Штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 ареактогенен при интраназальном введении детям 3-14 лет, что показано при испытаниях на волонтерах, где показатель реактогенности составил 0%.

Пример 2. Группу из 52 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл рекомбинантным вакцинным штаммом В/60/Иоханнесбург/05/99 с инфекционной активностью 6,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 46 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5^oС не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5^oС также не наблюдались. Показатель реактогенности составил 0%. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5^oС - в 3,8% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5^oС и средние температурные реакции не наблюдались. Слабые температурные реакции наблюдались у 6,5%.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам фармакопейной статьей ФС 42-298 ВС-89 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения детям 3-14 лет.

Паспорт штамма
1. Название штамма - В/60/Иоханнесбург/99/50.

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - рекомбинация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус - В/Иоханнесбург /05/99;
б) донор аттенуации В/СССР/60/69.

4. Количество пассажей - 5 в процессе рекомбинации
5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции - 33^o, 72 часа;
б) гемагглютинирующая активность 1:512;
в) инфекционная активность 8,5 lg ЭИД₅₀/ 0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;
д) разность в показателях инфекционной активности при 33 и 39^oС - 7,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 33 и 25^oС - 5,0 lg ЭИД₅₀/ 0,2 мл;
ж)структура генома рекомбинанта:
- гены от эпидемического вируса НА, NA;
- гены от донора аттенуации - PA, PB1, РВ2, NP, M, NS.

6) Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации: 10 сентября 2001 г.;
б) объем материала во флаконе: 1 мл;
в) количество доз во флаконе: 3;
г) инфекционная активность - 6,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;
д) гемагглютинирующая активность - 1:64.

7) Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:2.

8) Антигенная специфичность
а) гемагглютинина - идентичен вирусу В/Иоханнесбург/05/99 по данным РТГА с крысиной антисывороткой;
б) нейраминидазы - идентична вирусу В/Иоханнесбург/05/99 по данным реакции ингибирования нейраминидазы.

9) Безвредность для хорьков: безвреден при интраназальном введении.

10) Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 20 сентября 2001г - стерилен.

11) Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

ЛИТЕРАТУРА
1. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм В/60/Петербург/95/20 вируса гриппа В, используемый для получения живой интраназальной вакцины для взрослых и детей. - Патент РФ 2128224 от 27.03.99.

2. Александрова Г.И. БИ 13. 10.05.97.

3. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.-1994.-151с.

4. Merril C.R., Goldman D., Van Kluren M.L. Gel protein stains; silver stain. Methods Enzymology.- 1984.-V. 104.-p.441.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Вакцинный штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Иоханнесбург/05/99 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69. Штамм В/60/Иоханнесбург/99/50 активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 32-33^oС, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу), и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Штамм для взрослых и детей 3-14 лет при интраназальном введении и удовлетворяет показателям иммуногенности. 3 табл.

Штамм вируса гриппа В/60/Иоханнесбург/99/50, ГИСК 398/9 (Государственный институт стандартизации и контроля им. Л. А. Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей.