ШТАММ МИКРОМИЦЕТА FUSARIUM MONILIFORME - ПРОДУЦЕНТ ФИТОГОРМОНОВ ГИББЕРЕЛЛИНОВ А, А Российский патент 1997 года по МПК C12P27/00 A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/77 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности, к микробиологическому производству регуляторов роста растений и может быть использовано для получения фитогормонов гиббереллинов A₄/A₇ (ГА₄ и УА₇).

До настоящего времени в сельском хозяйстве широкое применение имел только ГА₃ (гибберелловая кислота). Однако среди других гиббереллинов несомненный интерес для практики могут представлять ГА₄ и ГА₇. Среди последних наибольший интерес представляет ГА₇, спектр действия которого намного шире, а физиологическая активность во многих случаях выше по сравнению с таковой ГА₃ и ГА₄. ГА₇ высокоактивный эндогенный регулятор роста растений, играющий важную роль в гормональной регуляции роста и развития растений, применяемый в различных научно-исследовательских работах. Эти факторы, позволяют предположить, что гиббереллин А₇ может найти широкое применение в сельском хозяйстве.

В мире производство ГА₇ единственный способ его высокоэффективного, рентабельного производства.

Основой микробиологического способа получения является штамм продуцент. Известны продуценты гиббереллина А₃ грибы вида Gibberella fujikuroi (Saw.) Wr. ), несовершенная стадия Fusarium moliforme (Sheld.) (Муромцев Г.С. Агнистикова В. Н. М. Наука, 1973; Kumor P.K.R. Lonsane B.K. Adv. Appl. Microbiol, 1989 Y. 34, P. 29 139), гиббереллина А₄ грибы рода Sphaceloma (Rademacher W. Graebe J.G. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1979, Y, 91, N. 1, P. 35 40; Kademacher W. Ph 1992, Y, 31, N. 12, P. 4155 - 4157). Продуцент гиббереллина А₇ (микроорганизм, образующий в качестве основного метаболита гиббереллиновой природы гиббереллин А₇ не известен, поэтому используют смеси ГА₄/ГА₇, в которых соотношение А₄/А₇ сильно варьирует.

В связи с этим создание штаммов-продуцентов, синтезирующих преимущественно ГА₇ является актуальным.

Техническим эффектом предполагаемого изобретения является штамм-продуцент ГА₇, образующий ГА₇ в качестве основного метаболита гиббереллиновой природы и характеризующийся высоким выходом фитогормона.

Технический эффект достигается за счет использования штамма гриба Fusarium moniliforme (Sheld.) F-446, выделенного из моноспорового изолята штамма, отобранного их пораженного растения риса, путем генерации протопластов. Получение штамма включало обработку протопластов УФ-светом.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N F-446 от 16.04.1990 г.

Штамм синтезирует 400 700 мг ГА₇ в 1 л культуральной жидкости за 8 10 дней глубинного культивирования и 20 80 мг ГА₄.

Заявленный штамм является первым полученным макропродуцентом ГА₇, способным к преимущественному образования ГА₇ и образующий ГА₃ лишь в следовых количествах и ГА₄ в незначительных количествах.

Культурально-морфологическая характеристика штамма гриба Fusarium moniliforme P-446
1. Рост на плотных средах
Штамм формирует колонии войлочного или ватного типа с хорошо развитым окрашивающимся с возрастом воздушным мицелием. Не образует экстрацеллюлярный пигмент и макроконидии.

На сусло-агаре культура быстрорастущая. Гриб образует субстратный и воздушный мицелий. Воздушный мицелий белый, пушистый. Колонии тяжистые, плотные, белые. Гриб образует микроконидии размером 4 18 х 5 4 мкм.

На картофельно-глюкозном (сахарозном) агаре воздушный мицелий развит от слабого до умеренного, плотный, прижатый к субстрату, белый. Субстрат не окрашен. Микроконидии одноклетные или с одной перегородкой, овальной формы. Спороношение не обильное. Микроконидии единичные с 2 3 перегородками, удлиненно-овальной формы.

На среде Ролен-Тома воздушный мицелий умеренно развитый, плотный, прижатый. От белого до слабо-фиолетового оттенков. Субстрат не окрашен. Единичные микроконидии, овальные, одноклетные. Макроконидии не отмечаются.

2. Физиолого-биохимические свойства
Строгий аэроб. Максимум роста на агаровых средах при 28^oC. утилизирует источники: углерода глюкоза, сахароза, растворимый крахмал, растительные масла; азота сульфат аммония, нитрат аммония, мочевина. Периодически пересеваемая культура. Штамм хранится на косяках с КСА (КГА) в холодильнике при 4^oC без пересевов в течение 1 2 месяцев. При ограничении доступа воздуха (пробки, залитые парафином) в течение 8-10 месяцев. Диссоциации при хранении не отмечается.

3. Погруженное культивирование
В погруженной культуре гриб растет равномерно, кашеобразно. Культуральная жидкость грязно-серого цвета.

Анализы HPLC (высокоэффективная хроматография) и ГХ-МС (газовая хромато-масс спектрометрия) показывает, что основным метаболитом штамма F-446 является ГА₇. Гиббериллин А₄ присутствует в культуральной жидкости штамма F-446 в качестве минорного метаболита (5-15%), гиббереллин А₃ менее 3%
Для получения ГА₇ штамм F-446 выращивали на скошенном картофельно-сахарном агаре или агаризованном солодовом сусле (7^oB) в течение 20-24 дней при 28^oC. Мицелиальную суспензию гриба в стерильной воде вносили в модифицированную жидкую посевную среду следующего состава (в масс.):
сахароза 3;
(NH₄)₂SO₄ 0,05;
CaCO₃ 0,7;
кукурузная или соевая мука 0,5;
pH перед стерилизацией 5,0-5,5.

Режим стерилизации 0,5 доб.атм. в течение 20 минут. Жидкий посевной материал выращивали в течение 46-48 часов в колбах на ротационной качалке 240 об/мин при 28^oC. Затем его использовали для инокуляции колб с ферментационной средой в количестве 1/10 объема среды. Ферментационные среды содержали в качестве источника углерода растительное масло (6,0-8,0%), источника азота NH₄NO₃ (1,0%) или пептон (1,0%).

Солевая основа ферментационных сред (в масс.):
KH₂PO₄ 0,1%
MgSO₄ 0,02%
pH нейтральный. Возможно добавление в среду кукурузного или дрожжевого автолизата (0,1) и 1 мл раствора смеси микроэлементов.

Ферментацию проводили на ротационной качалке 240 об/мин, в течение 8-10 дней при 28^oC. Количество инокулюма 5-10% Содержание ГА₇ в культуральной жидкости определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и ГХ-МС.

Пример 1.

Гриб Fusarium moniliform F-446 выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре в течение 14 суток. В качестве посевной использовали среду с сахаром и кукурузной мукой (См. выше), pH перед стерилизацией 5,5, после стерилизации 6,0, режим стерилизации 0,5 доб. атм. в течение 20 минут. Выращивание посевного материала проводили на ротационной качалке 240 об/мин, при 28^oC, в колбах на 500 мл.

Длительность культивирования гриба в посевной среде 46 часов, в ферментационной 10 суток (в тех же условиях).

Состав ферментационной среды (в масс.):
масло растительное 8
NH₄NO₃ 0,1
дрожжевой автолизат (Serva) 0,1
KH₂PO₄ 0,1
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
pH перед стерилизацией 5,8
В результате получена культуральная жидкость, содержащая 976 мг/л гиббереллинов, из которых 75% приходилось на долю А₇, 13% на долю А₄ и 3,6% на долю А₃.

Пример 2.

Условия культивирования гриба Fusarium moniliforme F-446 по описанию, приведенному в примере 1. Для засева колб с ферментационной средой использовали 10-дневную культуру, выращенную на скошенном картофельно-глюкозном агаре. Длительность процесса ферментации 8 дней. Ферментационная среда содержала кукурузный экстракт в количестве 0,1 масс. Содержание ГА₇ в культуральной жидкости составило 450 мг/л, ГА₄ 56 мг/л, ГА₃ 7 мг/л.

Пример 3.

Гриб Fusarium moniliforme F-446 выращивали в приведенных выше условиях на скошенном агаризованном солодовом сусле. Возраст культуры на твердой среде 10 дней, возраст посевного материала 48 часов. Длительность ферментации 10 дней.

Ферментационная среда содержала масло растительное и NH₄NO₃ и дрожжевой автолизат в количестве, соответствующем примеру 1.

Получена культуральная жидкость с содержанием ГА₇ 510 мг/л. Содержание ГА₄ 28 мг/л, ГА₃ 15 мг/л.

Пример 4.

Гриб Fusarium moniliforme F-446 выращивали на скошенном картофельно-сахарозном агаре в течение 7 суток. Выращивание посевного материала проводили на ротационной качалке в колбах на 500 мл (жидкая среда с сахарозой и кукурузной мукой) 48 часов при 27^oC.

Ферментацию проводили в 100 л ферментере на среде с подсолнечным маслом (60 г/л), кукурузным экстрактом (35 г/л) и ацетатом аммония (0,57 г/л). Объем среды 50 л, объем жидкого посевного материала 3 л, продолжительность ферментации 7 суток.

Содержание ГА₇ в культуральной жидкости составило 60% ГА₄ 25,6% ГА₃ 6,4%
Tаким образом, предлагаемый штамм гриба Fusarium moniliforme F-446, являющийся продуцентом фитогормона гиббереллина А₄/A₇, характеризуется преимущественным образованием ГА₇.

Область применения: биотехнология, микробиологическое производство регуляторов роста растений и касается нового штамма для производства гибереллинов A₄, A₇. Сущность изобретения: штамм микромицета Fusarium moniliforme выделен из моноспорового изолята штамма, отобранного из пораженного растения риса, путем регенерации протопластов. Штамм депонирован в ВКПМ под N F-446. Штамм синтезирует 400 - 700 мг гиббереллина A₇ и 20 - 80 мг A₄ в 1 л кукльтуральной жидкости за 8 - 10 дней глубинного культивирования.

Штамм микромицета Fusarium moniliforme ВКПМ F-446 продуцент фитогормонов гиббереллинов A₄, A₇.