ШТАММ МИКРОМИЦЕТА CERSOSPORA SP.- ПРОДУЦЕНТ ФИТОГОРМОНА АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству регуляторов роста растений и может быть использовано для получения фитогормона абсцизовой кислоты (АБК).

АБК-высокоактивный эндогенный регулятор роста растений, играющий важную роль в гормональной регуляции процессов фотосинтеза состояния покоя растений, адаптации к стрессам.

АБК широко применяется в различных научно-исследовательских работах. Спектр физиологической активности АБК, ее низкие действующие концентрации (10^-6-10^-4М, Мм 264,32 ед.) и экологическая безопасность позволяет предположить, что фитогормон может найти широкое применение в сельском хозяйстве.

АБК выпускается несколькими зарубежными фирмами ("Serva", "Sigma") в качестве химического реактива. Препарат представляет собой рацемическую смесь стереоизомеров, физиологической активностью при этом обладает только +энантиометр(цис, -транс-форма). Практическому применению этих препаратов АБК препятствует их чрезвычайно высокая цена до 100 долларов за 1 мг.

В России производство АБК отсутствует.

Микробный синтез АБК наиболее перспективный способ ее высокоэффективного, рентабельного производства, позволяющий значительно удешевить продукт и улучшить его качество за счет преимущественного синтеза физиологически активного стереоизомера.

Основой микробиологического способа получения является штамм-продуцент. Известны продуценты АБК, относящиеся к грибам родов Cercospora и Botrytis. За рубежом есть данные о штаммах Cercospora rosicola, синтезирующих 30 мг/л АБК за 14 дн культивирования (Norman S.M. et al. -Development of a defined medium for growth of a C.rosicola Passerini.-Appl. and Environ.microbial. 44,1,334-336, 1981) и 300 мг/л АБК при 20-дневном культивировании при использовании голубого света (Tokayama T. et al.-Microbial production of abscisic acid with C.rosicola. Biotechnology letters, 5, 59-62,1983).

Японскими исследователями описан штамм Botrytis sinerea, образующий до 50 мг/л АБК при культивированнии на агаризованной среде (Marymo S, et al-Microbial production of abscisic acid by Botrytis sinerea. Agricultura and Biol.chemistry, 46, 1967-1968, 1982)
В России известны 2 продуцента АБК: Botrutis senerea, образующий до 600 мкг/л АБК (Филимонова М.В. -Физиологически активные вещества фитопатогенных грибов рода Botrytis. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологический наук. Вильнюс 1987)и Cercospora rosicola, продуцирующая 10-20 мг АБК в 1 л культуральной жидкости при погруженном культивировании в течение 14 дн (Муромцев Г.С. и др. -Воздействие ретардантов и цитокинов на микробный синтез регуляторов роста растений терпеноидной природа. В сб. -Витамины и фитогормоны в растениеводстве, -Вильнюс, 82-84, 1986).

Таким образом, имеющиеся в СССР продуценты АБК не обладают достаточной активностью для обеспечения эффективного микробиологического синтеза фитогормона.

Целью изобретения является штамм-продуцент АБК, характеризующийся значительно более высоким выходом фитогормона по сравнению с указанными выше штаммами.

Поставленная цель достигается за счет использования штамма, представляющего собой моноспоровый изолят гриба Cercospora sp.F-444, выделенного из пораженного растения Rosa rugosa. Для определения родовой принадлежности штамма использованы определители: (Курсанов Л.И. Определить низших растений. -М. Просвещение, 1954.-Т.4.-326с. Семенов А.Я. Абрамова Л.П. Хохряков М.К. Определить паразитных грибов на плодах и семенах культурных растений,-Л. Колос, 1980.-302с).

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N F-444 от 16.04.1990 г.

Штамм синтезирует 60-120 мг АБК в 1 л культуральной жидкости за 10-12 дн глубинного культивирования.

К преимуществам предлагаемого штамма относятся: во-первых, высокое содержание АБК в культуральной жидкости (по этому показателю штамм значительно превосходит отечественные продуценты АБК), во-вторых, сокращение длительности процесса ферментации
Культурально-морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика штамма гриба Cercospora sp. F-444, (представлена в таблице).

1.Рост на плотных средах.

Штамм утилизирует широкий набор источников углерода и азота (солодовое сусло, картофельный отвар, кукурузный и дрожжевой автолизаты, глюкозу, сахарозу, крахмал, маннит, пептон, соевую муку, нитраты аммония, калия и натрия).

Гриб растет на средах с широким диапазоном значений pH: от 3,5 до 8,0. Интенсивный вегетативный рост обеспечивают температуры 23^o-28^oC.

Штамм характеризуется ограниченностью роста на плотных средах. Тип колонии по Сталперсу: бархатистая, гифы воздушного мицелия прямые, короткие, образуют плотный слой.

Спороношение отсутствует.

В таблице приведены основные культурально-морфологические характеристики штамма на плотных средах.

Штамм хранят на картофельно-глюкозном агаре под слоем стерильного минерального масла при 5^oC. Пересевы осуществляют не чаще одного раза в г. Также для хранения гриба можно использовать сыпучую среду на основе риса.

2. Погруженное культивирование. (в колбах, на ротационной качалке, 240 об/мин, при 25^oC).

Среда с глюкозой и аспарагином. Рост умеренный. Первую неделю гриб растет в виде пеллет, затем для культуры характерен кашеобразный рост. После 10-13 сут. культивирования наступает автолиз. Диаметр пеллет на 7-8 сут. составляет 1-5 мм, пеллеты шарообразные, пушистые, первые 3-4 дн белые, затем темно-зеленые, культуральная жидкость также темно-зеленого цвета. За 10 сут. культивирования образуется 40-45 г/л сырой биомассы.

Среда Ролен-Тома. Рост умеренный, первые дни в виде пеллет. Диаметр пеллет на 7-8 сут. составляет 1-3 мм, на 9-10 сут. 3-5 мм. Пеллеты шарообразные, пушистые, белого цвета, на 7-9 сут. темнеют до темно-зеленого цвета, культуральная жидкость такого же цвета. Кашеобразной консистенции культура достигает к 9 сут. Автолиз наблюдается на 12-14 сут. Накопление сырой биомассы-20-30 г/л за 10 сут. культивирования.

Среда с глицерином и пептоном. Рост хороший, первые 5-7 сут. в виде пеллет, затем культура достигает кашеобразной консистенции. Диаметр пеллет на 6-7 сут. составляет 1-5 мм, пеллеты шарообразные, пушистые, первые 6-7 сут. белого цвета, затем темнеют до коричнево-зеленого, культуральная жидкость светло-коричневая. Автолиз наступает после 10-12 суток культивирования. За 10 суток образуется 50-55 г/л сырой биомассы.

Для получения АБК гриб Cercospora sp. F-444 выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре или агаризованном солодовом сусле (7 Б) в течение 20-24 дн при 26^oC.

Мицелиальную суспензию гриба в стерильной воде вносили в модифицированную жидкую посевную среду Нормана следующего состава, в мас.

Глюкоза 1,80-2,00;
Аспарагин 0,14-0,30;
KH₂PO₄ 0,07-0,08;
MgSO₄ 0,015-0,02;
K₂SO₄ 0-0,02;
CaCl₂ 0-0,01;
Тиамин 0,0000005-0,000001;
1 мл раствора смеси микроэлементов
FeSO₄ 7H₂O 0,05
MnCl₂ 0,033 г
ZnSO₄ 0,25 г
CuSO₄ 4H₂O 0,4 г
H₃BO₃ 0,00005 г.

Режим стерилизации 0,5 доб.атм. в течение 20 мин.

Жидкий посевной материал выращивали в течение 6-8 дн в колбах на ротационной качалке 240 об/мин при 25^oC. Затем его использовали для инокуляции колб с ферментационной средой в количестве 1/10 объема среды. Ферментационные среды содержали в качестве источника углерода глюкозу (2,0%), сахарозу (2,0% ), глицерин (1,0%) + глюкозу (1,0%), в качестве источника азота нитрат натрия (0,3%) + кукурузный экстракт (10 мл/л.) или пептон (1,0%).

Солевая основа ферментационных сред в мас.

KH₂PO₄ 0,2;
MgSO₄ 0,02;
K₂SO₄ 0,02.

и 1 мл раствора смеси микроэлементов.

Ферментацию проводили на ротационной качалке 240 об/мин, в течение 7 дн при 26^oC. Содержание АБК в культуральной жидкости определяли с помощью спектрофотометрического метода, описанного в приведенной выше работе Нормана с сотрудниками.

Пример 1. Гриб Cercospora sp. F-444 выращивали на скошенном картофельно-глюкозном агаре в течение 22 сут. В качестве посевной среды использовалась среда с глюкозой и аспарагином, описанная в работе Нормана с сотрудниками.

Ее состав, в мас.

Глюкоза 2,00
Аспарагин 0,30
KH₂PO₄ 0,08
MgSO₄ 0,02
CaCl₂ 0,01
Tиамин 0,000001
и 1 мл раствора смеси микроэлементов; pH перед стерилизацией 6.5, после стерилизации 6.0, режим стерилизации 0.5 доб. атм. в течение 20 мин.

Выращивание посевного материала проводили на ротационной качалке 240 об/мин, при 25^oC, в колобах на 500 мл.

Длительность культивирования гриба в посевной среде 6 сут, в ферментационной 12 сут (в тех же условиях).

Состав ферментационной среды, в мас.

Сахароза 2,00;
Кукурузный экстракт 10 мл/л;
NaNO₃ 0,30;
KH₂PO₄ 0,20;
MgSO₄ 0,02;
K₂SO₄ 0,02,
и 1 мл раствора смеси микроэлементов; pH перед стерилизацией 6.0.

В результате получена культуральная жидкость, содержащая по данным спектрометрического метода определения 95 мг АБК в каждом л.

Пример 2. Условия культивирования гриба Cercospora sp. F-444 по описанию, приведенному выше. Для засева колб с ферментационной средой использовали 20-дневную культуру, выращенную на скошенном картофельно-гликозном агаре. Длительность процесса ферментации 12 дн.

Состав ферментационной среды, в мас.

Глюкоза 2,00;
Пептон 1,00;
KH₂PO₄ 0,20;
MgSO₄ 0,02;
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл раствора смеси микроэлементов.

Содержание АБК в культуральной жидкости составило 60 мг/л.

Пример 3. Гриб Cercospora sp. F-444 выращивали в приведенных выше условиях на скошенном агаризованном солодовом сусле. Возраст культуры на твердой среде 22 дн, возраст посевного на среде с глюкозой и аспарагином 7 дн. Длительность ферментации 10 дн.

Состав ферментационной среды, в мас.

Глицерин 1,00
Глюкоза 1,00
Пептон 1,00
KH₂PO₄ 0,20
MgSO₄ 0,02
K₂SO₄ 0,02
и 1 мл раствора смеси микроэлементов.

Получена культуральная жидкость с содержанием АБК 120 мг/л.

Таким образом использование выделенного нами штамма-продуцента АБК дает реальные возможности для дальнейшей разработки микробиологического способа получения АБК.

Использование: микробиологическая промышленность, производство регуляторов роста растений, в частности, фитогормона - абсцизовой кислоты (АБК). Сущность изобретения: Штамм микромицетата Cercospora sp. выделен из пораженного растения Rosa rugosa. Депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N F-444. Штамм синтезирует 60-120 мг АБК в 1 л культуральной жидкости за 10-12 дней глубинного культивирования. 1 табл.

Штамм микромицета Cercospora sp. ВКПМ F-444 продуцент фитогормона абсцизовой кислоты.