ПАРА ШТАММОВ ГЕТЕРОТАЛЛИЧНОГО ГРИБА BLAKESLEA TRISPORA КР 74 И КР 86, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ БЕТА-КАРОТИН Российский патент 2001 года по МПК C12P23/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам-продуцентам бета-каротина, применяемым в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности.

Бета-каротин играет важную биологическую роль в обеспечении многих физиологических функций организма. Он обеспечивает нормальный рост организма и развития плода, повышает активность половых гормонов, повышает устойчивость к инфекционным заболеваниям, обладает антимутагенной, антиоксидантной и радиопротекторной активностью. Сопряженными двойными C=C связями молекула бета-каротина поглощает свободные радикалы, защищая клетку от мутагенного и канцерогенного действия ионизирующей радиации и химических мутагенов, кроме того, он широко применяется в лечебно-профилактических препаратах, в пищевой промышленности, в масложировой, кондитерской, мясомолочной, пищеконцентратной, консервной и др. отраслях.

Наиболее активным продуктом для получения бета-каротина является гетероталличный гриб Blakeslea trispora, относящийся к порядку Mucorales.

Получение бета-каротина осуществлено путем совместного глубинного культивирования пары + и - штаммов продуцентов на питательных средах различного состава.

Известен патент РФ N 2053301, C 12 P 23/00, на пару штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora F 674 (+) и F 551 (-), продуцирующая бета-каротин. Штамм получают при совместном глубинном культивировании штаммов 185 Б (+) и 185 Б (-) на питательной среде простого состава в течение 114 ч. Уровень накопления бета-каротина в мицелии составляет 300000 мкг/100 мл культуральной жидкости /КЖ/.

Известен штамм продуцент бета-каротина по а.с. N 1476900, 1989, принятый нами за прототип. K1⁺ и K1^- селекционированы методом последовательного мутагенеза на реплицирующейся ДНК гриба с использованием нитрозогуанидина в концентрации 500 мкг/мл при выживаемости 0,02-0,1% для K1⁺ и комбинированного действия УФ-облучения (выживаемость 5-7-10%) и нитрозогуанидина в указанной концентрации. Полученный штамм в условиях лаборатории на качалках обладал активностью 155545 ед./100 мл КЖ и до 223794 ед./100 мл КЖ. При исследованиях на ферментерах в цехе активности составляли от 156860 до 191210 ед./100 мл КЖ, что в среднем составляло 177000 ед./100 мл КЖ.

Недостатком указанной пары штаммов является их относительно низкая продуктивность.

Нашей задачей является создание новой пары (+) и (-) штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora, обеспечивающей более высокий уровень биосинтеза бета-каротина при совместном росте.

Нами получена высокоэффективная пара штаммов KP 74⁺ и KP 86^- гриба Blakeslea trispora путем совместного культивирования штаммов K1⁺ и K1^-.

Для глубинного выращивания на колбах используют посевные и ферментационные среды: состав посевной среды, %:
мука соевая - 2,3;
мука кукурузная - 4,7;
KH₂PO₄ - 0,05;
витамин B1 - 0,002;
вода водопроводная или дистиллированная;
pH - 6,2-6,4.

Среду разливают по 100 мл и 150 мл в колбы объемом 750 мл, стерилизуют в режиме 0,3 атм 90 мин. Засев (+) и (-) формами отдельно спорово-мицелиальной суспензией и выращивают 48 час на качалках при 220-240 об/мин при 28^oC. После переносят в ферментативную среду. Состав ферментационной среды, г/л:
Зеленая патока - 38,0
Кукурузный экстракт - 21,5
KH₂PO₄ - 0,5
Витамин B1 - 0,002 (можно без витамина, так как кукурузный экстракт может полностью покрывать потребность в витамине. pH - 6,2 - 6,4. Условия стерилизации те же. Среду разливают в колбы по 60 мл и засевают в отношении 1: 10 (+) и (-) формы.

Морфологические свойства: гифы нитевидные, мощные, часто с перетяжками, образуют клубки. KP 74⁺ имеет хорошо развитый воздушный мицелий от серовато-желтого до желтого цвета. Субстратный мицелий - от светло-оранжевого до желто-оранжевого. Отмечается интенсивное спорообразование. Бесполое спороношение, только спорангиальное, представлено стилоспорангиями и спорангиями. Стилогоспорангии 50-100 мкм в диаметре. Спорангол - эллиптически-шаровидные 12х16 - 10х14 мкм, трехспоровые, многочисленные спорогноспоры также эллиптические 14х8, табачного цвета, имеют продольную исчерченность. KP 86^- воздушный мицелий развит хорошо, оранжево-желтого цвета или ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий - ярко-оранжево-красный и диффундирует цвет в среду.

Культуральные свойства: оптимальной средой роста гриба служит сусло-агар: гриб хорошо растет на мукоровом агаре, хуже на МПА, на среде Чапека. Наиболее характерным является рост на сусло-агаре, где (+) вариант имеет субстратный мицелий светло-оранжевого или желтого цвета, а (-) субстратный мицелий от ярко-оранжевого до красного окраса. На зоне стыка роста обеих половых форм образуется ярко-оранжево-красного цвета шириной от 15 до 20 мм. Этот признак является маркером заявляемого штамма и отличает его от исходного родительского штамма и штамма-прототипа.

Результаты опытов, полученных на качалках в лабораторных условиях, приведены в таблице
ПРИМЕР: после выращивания (+) и (-) форм на посевной среде (см. описание) в течение 48 часов при одинаковом накоплении биомассы KP 74⁺ и KP 86^- в соотношении 1:10 (в пересчете на сухую биомассу) ввели 1 мл KP 74⁺ и 9 мл KP 86^-. Общее количество посевного материала составляет 20% к объему среды для ферментации. Вырастили на качалках при 220-240 об/мин при 28^oC. Через 36 часов ферментации ввели 0,1% бета-ионона-стимулятора каротиногенеза и 0,01% антиоксиданта, и процесс ферментации длился 96 часов. После ферментации культуральную жидкость нагрели до 65^oC в течение 15 мин (для инактивации ферментов), профильтровали, и в биомассе определялась активность бета-каротина в мкг на 100 мл культуральной жидкости, которая составляла 300000 ед./100 мл.

На качалках активность штамма KP 74⁺ и KP 86^- на 40% выше штамма K1⁺ и K1^-. В цехе средняя активность штамма KP 74⁺ и KP 86^- составляет 280000 ед. /100 мл культуральной жидкости по сравнению с K1⁺ и K1^- 180000 ед./100 мл КЖ; максимальная активность нового штамма в цехе составляла 390000 ед./100 мл культуральной жидкости.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам - продуцентам бета-каротина. Пара новых штаммов гриба Blakeslea trispora KP 74⁺ и КР 86^- при совместном культивировании обеспечивают накопление бета-каротина до 390000 ед./100 мл культуральной жидкости. Технический результат изобретения состоит в более высоком уровне биосинтеза бета-каротина по сравнению с известными продуцентами. 1 табл.

Пара штаммов гриба Blakeslea trispora КР 74⁺ и КР 86^- - продуцент бета-каротина.