СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к дермато-венерологии, может применяться для диагностики сифилиса.

В качестве прототипа выбрана реакция связывания комплемента с трепонемным антигеном (PCK), входящая в общепринятый комплекс стандартных серологических реакций на сифилис.

Согласно инструкции серодиагностика сифилиса должна быть комплексной. В этот комплекс входят PB или PCK с двумя антигенами (кардиолипиновый и трепонемный), микрореакция типа БДРЛ, а по специальным показаниям реакция иммобилизации бледных трепонем и различные модификации реакции иммунофлюоресценции. Применение реакций в комплексе необходимо ввиду того, что при разных формах сифилиса чувствительность и специфичность реакций не одинаковы (Овчинников Н.М. Беднова В.Н. Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М. Медицина, 1987, с. 62).

Серологические реакции в первичном периоде сифилиса имеют важное значение при атипичных шанкрах, при самолечении, для установления длительности срока лечения и сроков наблюдения.

При вторичном свежем сифилисе классические серологические реакции положительны почти в 100% случаев. Большое значение серологические исследования имеют при распознавании нетипичных высыпаний на коже и слизистых оболочках, а также тогда, когда обнаружение бледных трепонем затруднено или невозможно. Повторные положительные серологические реакции подтверждают их сифилитическое происхождение, а отрицательные, также обязательно повторно произведенные, исключают сифилис. Не следует также забывать о возможности других заболеваний у больного сифилисом.

При вторичном рецидивном сифилисе серологические реакции положительны в 98-100% случаев. Диагноз вторичного свежего или рецидивного сифилиса при отрицательных серологических реакциях может быть установлен на основании наличия типичных клинических проявлений сифилиса и обнаружения бледных трепонем в отделяемом из очагов поражения. В трудно диагностируемых случаях незаменимую помощь при вторичном рецидивном сифилисе окажут РИФ и РИТ. Последние при этих формах сифилиса бывают положительными в 100 и в 95% случаев соответственно.

При третичном активном сифилисе РСК положительна у 70-75% больных. РИФ и РИТ положительны в 75-80% случаев. Положительные серологические реакции часто подтверждают диагноз, повторно произведенные отрицательные реакции в отсутствии других признаков сифилиса с известной долей вероятности исключают его.

Наибольшее значение серологические исследования крови приобретают при скрытом сифилисе, так как какие-либо наружные проявления сифилиса в это время отсутствуют.

В скрытом периоде сифилиса реакции бывают положительными в 40-98% случаев в зависимости от длительности заболевания, интенсивности предшествующей терапии и т.д. Диагностическое значение при этой форме сифилиса имеют только положительные результаты реакции.

Таким образом, значение серологических реакций для установления диагноза сифилиса из приведенного краткого обзора очевидно.

Являясь диагностической реакцией при сифилисе, РСК технически достаточно сложна и требует серолога высокой квалификации. Для постановки РСК требуются комплемент морской свинки, ежедневное его титрование с выбором рабочей дозы, гемолитическая сыворотка, эритроциты барана, антигены. В предлагаемом способе используется собственный комплемент. Поэтому сложная работа по приготовлению и титрованию комплемента морской свинки, инактивации испытуемых сывороток крови исключается.

Эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, являясь комплексом антиген-антитело, служат индикаторной системой при выявлении сифилитических антител в РСК. В предлагаемом способе индикаторной системой служат собственные нейтрофилы обследуемого. В связи с этим процедуры отмывания эритроцитов барана, стандартизация взвеси эритроцитов, сенсибилизация эритроцитов с гемолитической сывороткой, расчеты полностью исключаются.

Результаты РСК в случаях получения отрицательной реакции можно регистрировать к концу рабочего дня. При выпадении положительных, слабоположительных, сомнительных результатов РСК переставляется с этой же сывороткой крови на следующий день. Таким образом, окончательный результат выдается лишь на второй день.

Предлагаемым способом реакцию осуществляют в течение 40 мин. При необходимости перестановку можно провести в этот же день.

В силу того, что результаты реакции с помощью предлагаемого метода регистрируются хемилюминометром с программным управлением, многие элементы субъективизма при оценке данных исключаются. С помощью индекса стимуляции любые результаты можно выразить цифровыми значениями, стандартизирующими окончательные ответы реакции. Кинетические кривые хемилюминесценции нейтрофилов под влиянием комплекса антиген-антитело хорошо объективизируют результаты реакции и высвечиваются на мониторе. Экономическая нецелесообразность постановки РСК с малым количеством сывороток в предлагаемом способе приобретает целесообразность.

Техническим результатом изобретения являются повышение точности, упрощение и ускорение способа диагностики сифилиса. Предлагаемый способ можно использовать в качестве теста для экспресс-диагностики сифилиса наподобие микрореакции с кардиолипиновым антигеном на стекле, но в отличие от микрореакции в предлагаемом способе используется трепонемный антиген. Последний считается более чувствительным и специфичным, чем кардиолипиновый антиген.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Люминол готовят из расчета 10 мг на 100 мл забуференного физиологического раствора, рН 7,2 (далее ЗФР). Растворенный таким образом люминол помещают в холодильник при температуре +4^oC на магнитной мешалке в течение 24 ч. Затем фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 1,0 мл в пробирки и замораживают. Размораживают только необходимое количество люминола для каждого опыта.

Активную испытуемую сыворотку крови, предварительно разведенную в соотношении 1:10 в ЗФР, в количестве 0,2 мл вносят в две пробирки. Одна пробирка является контрольной, в нее приливают 0,2 мл ЗФР, вторая опытной, в которую добавляют разведенный по титру трепонемный антиген Стравропольского предприятия, инструкция по применению которого утверждена 15 декабря 1984 г. Минздравом СССР, в количестве 0,2 мл. Через 2-3 мин в обе пробирки приливают по 0,2 мл взвеси собственных нейтрофилов в концентрации 4,2 х 10¹¹/л по 0,1 мл люминола.

Таким образом, система для хемилюминесцентного анализа нейтрофилов представляет следующую схему:
Контрольная проба сыворотка крови больного + нейтрофилы больного + ЗФР + люминол
Опытная проба сыворотка крови больного + нейтрофилы больного + трепонемный антиген + люминол
При каждой постановке исследуют контрольные сыворотки: от больных сифилисом положительный контроль, от здоровых людей или от пациентов с другими заболеваниями несифилитической этнологии отрицательный контроль.

Опытные и контрольные пробирки помещают в хемилюминометр А/О "Мир-Диалог 3604", предварительно определив параметры опыта в программе исследования. Хемилюминесценцию нейтрофилов как для отдельной сыворотки (контрольная проба), так и смеси сыворотки с антигеном регистрируют в течение не менее 40 мин с 4-5-минутными интервалами. Хемилюминесценцию нейтрофилов каждой пробы измеряют в течение 1 с. Всего измеряют не менее 8 раз для получения кинетических кривых.

Наличие противотрепонемных антител в исследуемой сыворотке крови определяют по расположению кинетической кривой хемилюминесцентной пробы с трепонемным антигеном по отношению к хемилюминесцентной кривой нейтрофилов без антигена. Результаты хемилюминесцентного анализа нейтрофилов считают положительными и диагностируют сифилис в комплексе с анамнестическими и/или клиническими данными, когда кинетическая кривая хемилюминесценции нейтрофилов опытной пробы находится выше кривой контрольной пробы. Кроме того, при положительных результатах, следовательно, при наличии противотрепонемных антител кривые хемилюминесценции нейтрофилов контрольной и опытной проб не пересекаются и имеют характерный вид.

Увеличение интенсивности хемилюминесценции нейтрофилов при образовании комплекса сыворотка (антитела) и специфический антиген (трепонемный антиген), а также собственный комплемент выражают индексом стимуляции.

Индекс стимуляции (ИС) отношение максимальной интенсивности хемилюминесценции нейтрофилов опытной пробы к интенсивности контрольной пробы. Как правило, положительные результаты хемилюминесцентного метода определяют при ИС 1,1 и выше. На рис. 1 и 2 показаны положительные результаты хемилюминесцентного метода с разными показателями ИС. На рис. 3-5 показаны отрицательные результаты предлагаемого способа. Кривые, отражающие отрицательные результаты хемилюминесцентного метода с трепонемным антигеном, находятся ниже кривых контрольной пробы (без трепонемного антигена), или обе кривые определяются на одном уровне. При этом ИС составляет 1,0 или меньше 1,0. Иногда могут иметь место отдельные вспышки хемилюминесценции ИС 1,1 и выше, как показано на рис. 5. Однако кривые хемилюминесценции нейтрофилов опытной пробы не имеют характерного вида, пересекаясь во многих точках измерения. Поэтому только оценка формы и кинетики хемилюминесцентного эффекта нейтрофилов позволяет правильно оценить полученные результаты.

Для наглядности определения ИС приводим пример протокола исследования опыта от 5.05.94 г. (см. табл. 1).

Интересующие нас пробирки для больного сифилисом представляют N 4 и N 5, из которых N 4 контрольная проба, N 5 опытная, с трепонемным антигеном. Параметры для данного опыта: пауза 1 с интервал 4 мин, количество измерений -8.

На 24-й минуте (6-е измерение) наблюдался пик хемилюминесценции нейтрофилов опытной пробы (N 5) 2130, против 1491 контрольной пробы (N 4). ИС составил 2130 1491 1,4. Для второго больного сифилисом контрольная проба была под N 9, опытная N 10. Пик хемилюминесценции нейтрофилов опытной пробы наблюдался на 20-й минуте и составил 60062 против 1786 контрольной пробы. ИС 6062 1786 3,4.

Пробирки по N 14 и 15, 23 и 24 составили отрицательные контрольные исследования больных атопическим дерматитом. В течение всего времени измерения хемилюминесценция нейтрофилов опытных проб не превышала хемилюминесценцию нейтрофилов контрольных проб. Лишь в конце измерения отмечалось некоторое повышение ХЛ опытных проб с ИС на уровне единицы. Например: 1634 1621 1,0 (6-е измерение); 1801 1723 1,04; 1480 -1450 1,0.

Для определения титра противотрепонемных антител в исследуемых сыворотках хемилюминесцентный метод по описанной схеме осуществляли с разведениями сывороток, начиная с 1:10 до 1:320. Каждое разведение исследуют на опытах и контрольных пробах. Разведение сыворотки крови, с которым наблюдается хемилюминесценция нейтрофилов с характерной кинетической кривой с индексом стимуляции 1,1 и выше, является титром противотрепонемных антител по предлагаемому способу.

В норме большинство нейтрофилов пребывают в инертном, покоящемся состоянии. Их функциональные возможности раскрываются только на фоне стимулирующих воздействий (Маянский А. Н. Маянский А.Д. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск, 1983, с. 9-11, 38-46).

Схему реакции нейтрофила в виде хемилюминесцентного эффекта под воздействием иммунных комплексов (трепонемный антиген + антитела + комплемент) можно представить следующим образом (рис. 6). С помощью рецепторов для СЗв осуществляется связывание нейтрофилами иммунных комплексов. Действие последних как стимулирующих факторов сводится к активации мембранных оксидаз, которые катализируют перенос электронов с НАДФ.H₂ на молекулярный кислород, запуская ГМФШ. По законам внутриклеточного гоместаза ГМФШ нарабатывает новую порцию НАДФ.H₂- оксидаз, участвуют НАДФ.H₂-оксидазы, а следовательно, и метаболические пути, обеспечивающие восстановление НАД+ в НАД.H₂, которые не связаны с ГМФШ.

Стимуляция нейтрофилов иммунными комплексами резко увеличивает расход глюкозы в реакциях ГМФШ. Одновременно значительно возрастают потребление кислорода и образование биоксидентов перекиси водорода и свободных радикалов: супероксидного аниона, гидроксильного радикала, синглетного кислорода. Внезапность и скорость, с которой возникают и развиваются эти реакции, послужили поводом для образного сравнения со взрывом, световая энергия которого регистрируется хемилюминесценцией нейтрофилов хемилюминометром.

На 5 мая 1994 г. с помощью предлагаемого способа было проведено обследование 76 человек с клиническими проявлениями сифилиса, 9 с анамнестическим подозрением на это заболевание. Среди них предлагаемый способ первичный серопозитивный сифилис подтвердил у 21 больного, вторичный свежий - у 18, вторичный рецидивный у 37. У 9 обследованных было подтверждено анамнестическое подозрение и установлен ранний скрытый сифилис. При обследовании 65 больных псориазом, атопическим дерматитом, фурункулезом предлагаемый способ выявил положительный результат предлагаемого способа у 1 больного. Углубленное обследование этого больного с привлечением других специалистов и специфических реакций РИТ и РИФ позволило расценить этот положительный результат как ложноположительный.

Количественное выражение результатов предлагаемого способа представлено в таблице 2. Достоверно повышенные индексы стимуляции, отражающие наличие противотрепонемных антител, убедительно указывают на динамику хемилюминесцентного эффекта нейтрофилов в зависимости от формы заболевания. Более высокие показатели индекса стимуляции наблюдаются при вторичном сифилисе.

Анализ частоты регистрации различных показателей индекса стимуляции показывает (табл. 3), что стимулирование нейтрофилов комплексом антиген-антитело в 1,2-2,0 раза чаще наблюдалось при первичном сифилисе. Впрочем, такая стимуляция нейтрофилов отмечались у большинства больных при всех формах сифилиса.

Индексы стимуляции на уровне 1,1, наоборот, отмечались у небольшого числа больных. Эти данные указывают на достаточную чувствительность и специфичность предлагаемого способа.

Исследования показали, что колебания титра противотрепонемных антител в исследуемых сыворотках по хемилюминесцентному методу составляют от 1:10 до 1:320 при всех формах сифилиса.

В то же время колебания титра антител по РСК при первичном и вторичном сифилисе составили от 1:5 до 1:160, скрытом от 1:5 до 1:80. Эти данные также указывают на чувствительность предлагаемого способа.

Преимущество предлагаемого способа проявляется при выявлении антител низкой концентрации, когда РСК показывает еще отрицательные результаты. Это можно продемонстрировать следующим примером.

У больного Я-го, 25 лет, при осмотре обнаружены клинические проявления, характерные для первичного сифилиса. РСК с трепонемным антигеном была отрицательной. Предлагаемый способ подтвердил у больного наличие сифилиса. Кинетическая кривая хемилюминесценции нейтрофилов в системе сыворотка-антиген была выше контрольной пробы с индексом стимуляции 1,15. В дальнейшем клиническое подозрение и состоятельность предлагаемого способа подтвердились обнаружением в отделяемом первичного аффекта возбудителя сифилиса.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о целесообразности применения хемилюминесцентного метода для выявления противотрепонемных антител.

Использование: в медицине для диагностики сифилиса. Сущность изобретения: исследуют реакцию антиген-антитело в пробе крови пациента в присутствии ультраозвученного трепонемного антигена. Исследование проводят в кювете хемилюминометра. Регистрируют кинетику интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов. Диагностику осуществляют по характеру кинетических кривых. Технический результат: повышение точности способа, ускорение и упрощение его. 6 ил., 3 табл.

Способ диагностики сифилиса, включающий исследование реакции антиген-антитело в пробе сыворотки крови пациента в присутствии ультраозвученного трепонемного антигена с последующей оценкой результатов реакции по диагностически значимому показателю, отличающийся тем, что исследование проводят в кювете хемилюминометра, в пробу дополнительно добавляют люминол и аутологичные нейтрофилы, затем регистрируют кинематику интенсивности хемилюминесценции в течение не менее 40 мин, при длине волн 300 400 нм с интервалом между измерениями в 4 5 мин, в качестве диагностически значимого показателя используют характер полученной кинематической кривой, при этом оценивают реакцию положительной в случае расположения кинематической кривой опыта выше кривой контрольной пробы и отсутствия пересечения между ними в интервале измерения 15 30 мин.