СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОЦЕССА ИНТЕГУМЕНТНЫХ ФОРМ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, может применяться для определения активности процесса интегументных форм красной волчанки (далее ИКВ).

Особенности клинических проявлений при дерматологических формах красной волчанки, моно- и малосиндромное хроническое течение, частое несоответствие между исчезновением клинических проявлений болезни и сохранением патологических сдвигов лабораторных показателей аргументируют необходимость оценки активности патологического процесса.

Определение активности процесса ИКВ проводят, в первую очередь, по характеру и динамике клинических проявлений: выраженность эритемы, распространенность очага, появление новых элементов, частота появления рецидивов и т. п. Однако этот способ во многом является субъективным и зависит от наблюдательности больного и опыта врача.

За прототип предлагаемого способа определения активности процесса интегументных форм красной волчанки выбран известный способ определения активности ИКВ, включающий исследование сыворотки крови пациента до проведения курса лечения, регистрации уровня биохимического показателя с последующим сравнением с данными контроля.

Взаимозависимость перечисленных показателей и активности у больных эритематозом на фоне показателей СОЭ и лейкоцитоза представлены в таблице.

Следовательно, оценка активности проводится по повышенному содержанию показателей. Вместе с тем, в активном периоде ИКВ повышенное содержание фибриногена наблюдается у 41,7% больных, гаптоглобина - у 52,7%, церулоплазмина - у 33,3%, т.е. точность способа недостаточно высока, даже по данным прототипа.

Проведенные исследования показали, что этот процент не превышает 41,2%. Содержание гликопротеидов во многом зависит от гепатотропной патологии. При проведении анализа полученных данных надо осуществлять 3 вида лабораторных анализов. Эти анализы невозможно осуществлять одновременно и параллельно из одной и той же порции крови при постановке общепринятых серологических реакций, не травмируя дополнительно больного. При интерпретации результатов исследования конкретного больного зачастую возникают трудности в связи с дискордантными данными трех показателей.

Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа, снижение его травматичности.

Поставленная цель достигается тем, что в сыворотке крови больного регистрируют уровень антител к пре- β-липопротеидам и при выявлении антител определяют наличие активности. Антитела к пре- β-липопротеидам регистрируют в реакции иммунофлюоресценции, при этом предварительно смешивают сыворотку пациента с раствором липопротеида печени человека, инкубируют смесь при 37^оС в течение 15-30 мин, затем смесь наносят на стекло с фиксированными лимфоцитами крыс, повторно инкубируют во влажной камере, отмывают полученный препарат, наносят на него люминесцентную сыворотку против глобулинов человека, вновь инкубируют во влажной камере при комнатной температуре, а затем подсчитывают число светящихся лимфоцитов к общему количеству клеток в поле зрения.

Количественное соотношение ингредиентов подобрано экспериментальным путем. Результаты опытов отражены на фиг.1-3. По оси абсцисс: различное содержание белка в липопротеиде (мг/мл по белку), на фиг.3 - количество ВМБ в мл, что соответствует мл липопротеида по белку: по оси ординат: процент выявляемых светящихся клеток.

Стандартное содержание белка в ампуле липопротеида составляет 0,860 мг/мл, а в проведенном опыте - в 0,011 мл липопротеида содержание белка составляет 10 мг/мл, в 0,017 - 15 мг/мл, в 0,023 - 20 мг/мл, в 0,029 - 25 мг/мл. На фиг.1 пик светящихся клеток лимфоцитов приходится на содержание 15 мг/мл в липопротеиде - больше 80%. На фиг.2 показаны результаты первого контроля.

В дозе белка 15 мг/мл - результат отрицательный. На фиг.3 результаты 2-го контроля, которые аналогичны таковым первого контроля.

Реакция антиген-антитело in vitro при температуре 37^оС обычно завершается в течение нескольких минут. Например, реакцию преципитации, в частности реакцию Кана, используемую при серологической диагностике сифилиса, проводят в течение 10 мин. В проведенном же опыте результаты соединения антигена с антителом оценивали не по реакции преципитации, а по изменению клеток, т. е. имели дело с более сложным механизмом образования комплекса антиген-антитело. При этом изменяли один показатель - показатель белка в липопротеиде и допустили, что наилучшее время 15 мин. Последующие этапы реакции проводили в течение 30 мин, исходя из того, что по известным данным иммунологические реакции на этапе включения индикаторной системы, как правило, проходят в течение 30 мин.

Необходимость использования в качестве клеток мишеней при постановке непрямой реакции иммунофлюоресценции лимфоцитов крыс аргументирована тем, что лимфоциты крыс имеют рецепторы для иммуноглобулинов, не содержат белков человека, что исключает возможность неспецифического свечения при последующей обработке препаратов меченой антиглобулиновой сыворотки. При этом нет необходимости учета групповой субстанции лимфоцитов. Особенности моpфологического состава периферической крови, в частности большее количество лейкоцитов в 1 мм крови (5000-25000, в среднем 12500), чем у кроликов (8500-19000) и морских свинок (5000-16000), а также процентное содержание лимфоцитов в лейкоцитарной формуле у крыс (65-75) против 42,2 и 43 - у кроликов и морских свинок, дают возможность с большей вероятностью выделить желаемое количество лимфоцитов.

Анализ липопротеидов эритроцитарных мембран и лимфоцитов здоровых крыс при электрофорезе в ПААГе показал содержание пре- β-липопротеидов в пределах 28,2-73,2% соответственно. Таким образом, с учетом того, что коммерческий липопротеид, использованный в качестве антигена, также представлен пре- β-липопротеидами (проверено в ПААГе), применение лимфоцитов в качестве клеток-мишеней вполне оправдано.

На фиг.1 показан график зависимости частоты выявления (%) флюоресцирующих клеток от содержания ЛПЧ по белку; на фиг.2 - график зависимости активности ЛПЧ по белку от частоты выявления флюоресцирующих клеток (%); на фиг. 3 - график зависимости частоты выявления флюоресцирующих клеток (%) от содержания антилимфоцитарных антител в сыворотке крови, разведенной в различных соотношениях.

Лимфоциты крыс в предлагаемом способе впервые используются в качестве клеток-мишеней в индикаторной системе.

Выработан принципиально новый подход при оценке результатов в контроле в связи с тем, что у больных ИКВ могут обнаруживаться антитела к лимфоцитам, с одной стороны, а с другой стороны, липопротеид человека, соединяясь с антиглобулиновой сывороткой человека, тоже может дать свечение. Таким образом, предложенный новых подход к оценке результатов в контроле практически исключает ложно-положительные результаты. Сам же подход заключается в том, что вычисляется процент светящихся клеток из общего количества их в опытной пробирке при отсутствии свечения в контрольных. В известных же способах обычно пользуются индексацией.

Оптимальные условия проведения реакции предложены впервые в данном изобретении и обоснованы опытным путем.

Положительный эффект заключается в следующем:
повышение точности определения активности процесса ИКВ (в прототипе точность составляет 33,3-52,7% по полученным данным не выше 41,2%, в предлагаемом способе 77,5%);
снижение травматичности способа за счет исключения необходимости многократного взятия крови;
упрощение определения активности ИКВ за счет уменьшения количества анализируемых показателей (в прототипе 3, в предлагаемом способе 1).

Способ осуществляют следующим образом. Готовят взвесь лимфоцитов крыс и наносят на предметные стекла. Для гашения аутофлюоресценции фиксируют препараты в химически чистом ацетоне в течение нескольких минут (выливают на препараты ацетон и тут же сливают). У больного берут кровь и получают сыворотку обычным способом, например как для реакции Вассермана. В опытную пробирку наливают 0,02 мл сыворотки крови больного и 0,017 мл коммерческого липопротеида печени человека (15 мг/мл по белку). В первую контрольную пробирку приливают 0,02 мл сыворотки крови больного и 0,017 мл веронал-мединалового буфера: рН = 7,2 (ВМБ), во вторую - 0,02 мл коммерческого липопротеида и 0,017 мл ВМБ. Пробирки инкубируют в термостате 15-30 мин при температуре 37^оС, предварительно закрыв пробками во избежание высыхания. Затем содержимое пробирок наносят на приготовленные препараты лимфоцитов и инкубируют во влажной камере в течение 30 мин а термостате при температуре 37^оС. Промывают 3 раза в ВМБ в разведении 1:5. Слегка высушивают и наносят люминисцирующую сыворотку против глобулинов человека, предварительно оттитрованную и истощенную эритроцитами крыс. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. Промывают 3 раза в ВМБ, высушивают. Результаты регистрируют с помощью люминесцентного микроскопа типа "Люмам" путем подсчета светящихся лимфоцитов из общего количества клеток. Например, всего клеток 100 в поле зрения (в опытной пробирке) из них 8 имеют свечение. Тогда результаты выражают в процентах - 8%. Следовательно антитела к пре-β -липопротеидам обнаружены. При регистрации результатов контрольных пробирок свечение отсутствует, имеются лишь тени лимфоцитов.

П р и м е р 1. Больной К., 32 г., история болезни N 3373. Диагноз: дискоидная красная волчанка. Длительность заболевания около 28 лет. Из перенесенных болезней отмечает простудные заболевания. Сопутствующее заболевание: вазомоторный ринит. Семейный анамнез не отягощен. Исследование сыворотки крови показало содержание гаптоглобина в пределах нормы (1,45 г/л при норме от 0,86 г/л до 1,65 г/л), церулоплазмина 30,5 мг% (против 30,0+0,36 в контроле), СОЭ 40 мм/ч. Результаты по выявлению антител к липопротеиду были положительными. Последние и СОЭ свидетельствовали об активности процесса у больного ИКВ. Действительно, на коже лица имеется яркая эритема с шелушением, атрофией. Показатели предлагаемого способа коррелировали с клиническими пpизнаками активности ИКВ, в то же время параметры прототипа носили дискордантный характер: СОЭ повышена, содержание гаптоглобина в пределах нормы.

П р и м е р 2. Больной Н., 29 лет, история болезни N564. Диагноз: дискоидная красная волчанка. Длительность заболевания не превышает 1 года. Из перенесенных заболеваний больной отмечает грипп, ангину, сопутствующих заболеваний нет. Больной обследуется в стадии клинической ремиссии, т.е. на коже лица манифестные признаки ИКВ отсутствуют. В сыворотке крови определяются содержание гаптаглобина в пределах нормы (0,95 г/л), СОЭ 6 мм/ч. Лабораторные и клинические данные свидетельствовали об отсутствии активного процесса ИКВ. Вместе с тем, обнаруженные антитела к липопротеиду в сыворотке крови позволяют высказать суждение о происходящих активных деструктивных процессах. Действительно, через месяц появились клинические признаки обострения кожных проявлений: яркая элеватная эритема с четкими границами, появился зуд, хотя содержание гаптоглобина было в пределах нормы (1,2 г/л), СОЭ 2 мм/ч. Таким образом, предлагаемый способ оказался информативнее для оценки активности процесса при ИКВ.

П р и м е р 3. Больной У., 29 лет, история болезни N1366. Находился в клинике по поводу дискоидной красной волчанки. Длительность болезни 4 года. Из перенесенных заболеваний отмечает острые респираторные заболевания. Сопутствующих заболеваний нет. До поступления в стационар ничем не лечился. Исследование сыворотки показало содержание гаптоглобина в пределах нормы (1,55 г/л), СОЭ 5 мм/ч. Антитела к липопротеиду не обнаружили. Вместе с тем на коже лица имелись 3 очага, представленные элеватной эритемой. Больного беспокоит чувство жжения. Из анамнеза удалось выяснить, что самостоятельного регресса проявлений не было, за последние 6 месяцев появился новый очаг. Анамнестические и клинические признаки свидетельствуют об обострении кожного процесса, в то же время как предлагаемый способ, так и прототип не выявляют признаков активности процесса.

С помощью предлагаемого способа в клинике кафедры кожных и венерических заболеваний ГМИ им. С. М.Кирова на базе Нижегородского научно-исследовательского кожно-венерологического института МЗ РФ обследовано 40 больных интегументными формами красной волчанки. Среди больных было 6 женщин и 34 мужчины в возрасте 20-70 лет (средний возраст 39,5+2,9). Длительность болезни варьировала от 4 месяцев до 20 лет (в среднем 8,6+1,5).

Клинические проявления в виде эритемы, фолликулярного гиперкератоза, атрофии наблюдались у большинства больных на коже лица и носили ограниченный характер, у 4 из них изменения кожи имели распространенную форму: кожа груди, спины, волосистая кожа головы.

Часть больных имела сопутствующую патологию: рубромикоз (1), аллергический ринит (1), акариаз (2), вегетососудистая дистония (2), астмоидный бронхит (1), люмбоишалгия (1).

Исследования показали, что антитела к пре -β -липопротеидам с помощью предлагаемого способа при наличии обострения процесса обнаружены у 77,5% больных, в то время как повышенное содержание одного из показателей прототипа - гаптоглобина - у 41,2% (Х² = 10,2; Р < 0,005), церулоплазмина - у 27,3% (Х² = 11,05; Р < 0,001).

Сопоставление результатов выявления антител от наличия сопутствующих заболеваний показало отсутствие достоверных различий как по частоте их выявления (Х² = =0,8; Р > 0,05), так и по средним показателям 26,0+10,0% - при наличии сопутствующих заболеваний, 16,0+9,0% - отсутствии последних, Р > 0,05.

Антитела к пре-β -липопротеидам были определены и иммуноферментным методом на твердофазном носителе, однако чувствительность этого метода оказалась ниже предлагаемого: 48,8% и 77,5% положительных результатов соответственно (Х² = 7,3; Р < 0,01).

Определение антител проводили у больных в период регресса клинических симптомов, после ликвидации обострения кожного процесса. При этом отмечалось достоверное снижение частоты выявления антител 20,0%, Х² = 8,6; Р < 0,01 по сравнению с данными при обострении ИКВ).

Корреляционный анализ результатов предлагаемого метода и данных по обнаружению антител к лимфоцитам и ДНК выявил наличие умеренной связи между изучаемыми параметрами (r = 0,4; r = -0,4 соответственно).

Таким образом, наличие антител к пре- β-липопротеидам коррелирует с активностью кожных проявлений у больных ИКВ. Предлагаемый способ отличается большей чувствительностью (точностью) в период обострения процесса по сравнению с ранее известными методами, какими являются показатели гаптоглобина, церулоплазмина. Наличие связи антител к пре- β-липопротеидам с антилимфоцитарными антителами и ДНК, т.е. к компонентам клетки наводит на мысль об одинаковой природе происхождения антител в результате деструктивных процессов. Иными словами, антитела к пре- β-липопротеидам являются объективными отражателями патогенетической сущности ИКВ.

Использование этого метода возможно параллельно с другими серологическими исследованиями, например на ВИЧ-инфекцию, сифилис, т.е. при осуществлении способа не требуется специальной подготовки испытываемого материала, обработки инструментария, дополнительной венопункции, сложного оборудования. Постановку реакции можно осуществлять в любой лаборатории, имеющей люминесцентный микроскоп.

Использование: в медицине, дерматовенерологии, для определения активности процесса интегументных форм красной волчанки (ИКВ). Цель - повышение точности и упрощение способа, снижение его травматичности. Сущность изобретения: in vitro у больных ИКВ определяют антитела к пре- β -липопротеидам. 1 з.п.ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОЦЕССА ИНТЕГУМЕНТНЫХ ФОРМ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ, включающий исследование сыворотки крови пациента до проведения курса лечения, регистрации уровня биохимического показателя с последующим сравнением с данными контроля, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, снижения его травматичности, регистрируют уровень антител к пре- β - липопротеидам и при выявлении антител определяют наличие активности. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитела к пре- β - липопротеидам регистрируют в реакции иммунофлуоресценции, при этом предварительно смешивают сыворотку пациента с раствором липопротеида печени человека, инкубируют смесь при 37^oС в течение 15 - 30 мин, затем смесь наносят на предметное стекло с фиксированными на нем лимфоцитами крыс, повторно инкубируют во влажной камере, отмывают полученный препарат, наносят на него люминесцентную сыворотку против глобулинов человека, вновь инкубируют во влажной камере при комнатной температуре, а затем подсчитывают число светящихся лимфоцитов к общему количеству клеток в поле зрения.