СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 1997 года по МПК C12P7/50 A01N63/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения регуляторов роста растений, а именно фитогормона абсцизовой кислоты (АБК).

АБК фитогормон терпеноидной природы, играющий важную роль в таких процессах, как фотосинтез, обеспечение состояния покоя растений, формирование реакций на повреждающее воздействие и других. АБК широко используется в научных исследованиях в качестве реактива, но ее практическому применению в сельском хозяйстве препятствует отсутствие эффективного и доступного способа получения.

За рубежом АБК производится путем тонкого химического синтеза, который приводит к образованию рацемической смеси энантиомеров, выделение же физиологически активного цис-транс-изомера является дорогим процессом. Более перспективным и дешевым способом получения АБК является микробиологический синтез, который позволяет избирательно получать физиологически активный стереоизомер.

Известные в литературе работы по микробиологическому синтезу АБК (Norman S. M. et al. "Influence of Nitrogen Source, Thiamine, and light of Biosynthesis of Abscisic Acid by Cercospora rosicola Pass.-Applied and Environ. microbial.vol 41, 1, p.981-985, 1981) были проведены в лабораторных масштабах, при этом для выделения и очистки АБК использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию высокого давления. Этот метод неприемлем для производственных масштабов, т.к. рассчитан на ограниченные объемы, требует дорогостоящего оборудования, сложной предварительной обработки культуральной жидкости.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и удешевления процесса выделения АБК из культуральной жидкости.

Поставленная цель достигается с помощь предлагаемого способа, отличающегося тем, что с целью повышения эффективности выделения АБК культуральную жидкость фильтруют через мембранные фильтры типа Sartorius с диаметром пор порядка 0,8 мкм фильтрат подают в колонку заполненную высокопористой неполярной смолой неионного характера, представляющей собой сополимер стирола с дивинилбензолом, и элюируют сорбированную АБК 20-50% водным раствором ацетона.

Способ осуществляется следующим образом.

После завершения ферментации культуральную жидкость фильтруют от мицелия через полотно бязи, затем через мембранный фильтр с диаметром пор 0,8 мкм (типа "Sartorius"). Полученный фильтрат не содержит взвешенных частиц, белков и жиров. Фильтрат пропускают через колонку, заполненную высокопористой неполярной неионной смолой. Примеры подходящих сорбентов сополимеры стирола с дивинилбензолом, такие как Полисорб 60/100 или Полисорб 40/100. Элюирование целесообразно проводить водным ацетоном с градиентом 10% в диапазоне концентраций от 20% до 50% Контроль элюирования осуществляют спектрофотометрически. Собирают фракции, содержащие АБК, упаривают ацетон и целевой продукт выделяют из водной фазы перекристаллизацией с органическими растворителями, например гексаном, при pH 2,2-3.1.

Из небольших партий элюита АБК можно выделить также с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем.

Способ иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.

Пример 1. Для выделения АБК использовали отфильтрованную культуральную жидкость гриба Cercospora sp. F-444, содержащую 200 мг/л АБК.

Через сорбционную колонку, заполненную высокопористой неполярной сорбционной смолой неионного характера типа Полисорб 40/100, пропускают сверху вниз фильтрат культуральной жидкости со скоростью 1,5 объема на объем сорбента в ч (1,5ч. ^-1) до момента появления в элюате следов этого продукта, примерно 2 объема культурального фильтрата на 1 объем сорбента. Затем пропускают через колонку в том же направлении водный раствор ацетона (с градиентом 10%) от 20% раствора ацетона до 50% раствора со скоростью 2ч^-1, причем объем каждой фракции равен объему сорбента, а объем 40% раствора равен двум объемам сорбента. Из фракции под уменьшением давлением отгоняют ацетон и из водного остатка выделяют кристаллическую АБК путем перекристаллизации с гексаном при пониженном pH. Регенерацию сорбента проводят 80% раствором ацетона.

Выход продукта составляет 56% от количества АБК, содержащегося в культуральной жидкости по результатам спектрофотометрического метода определения.

Пример 2. Извлекают АБК из культуральной жидкости как в примере 1 с тем отличием, что для десорбции фитогормона применяют водный раствор, содержащий 40% ацетона в объеме, равном 3-м объемам сорбента.

Выход продукта составляет 60% от количества, содержащегося в культуральной жидкости и определенного спектрофотометрическим методом.

Пример 3. Извлекают АБК из культуральной жидкости как в примере 1, с тем отличием, что для заполнения колонки используют высокопористую неполярную сорбционную смолу неионного характера типа Полисорб 60/100, и для десорбции АБК применяют водный раствор 40% ацетона в объеме, равном 4-м объемам сорбента.

Выход продукта составляет 69% от количества, содержащегося в культуральной жидкости гриба и определенного спектрофотометрическим методом.

Использование: микробиологическая промышленность, производство регулятора роста растений, а именно абсцизовой кислоты /АБК/. Сущность изобретения: культуральную жидкость, полученную культивированием микромицета Cercospora sp. , фильтруют через бязевое полотно, затем через мембранные фильтры типа "Sartoriys" с диаметром пор 0,8 мкм, полученный фильтрат пропускают через колонку, заполненную высокопористой неполярной смолой неионного типа, представляющую собой сополимер стирола с дивенилбензолом, затем абсцизовую кислоту элюируют водным раствором ацетона с градиентом 10 в диапазоне концентрации 20-50%. Способ обеспечивает извлечение до 70% от количества АБК, содержащегося в культуральной жидкости.

Способ выделения абсцизовой кислоты из культуральной жидкости, предусматривающий фильтрацию культуральной жидкости, пропускание фильтрата через колонку с адсорбентом с последующей элюцией абсцизовой кислоты, отличающийся тем, что фильтрацию культуральной жидкости осуществляют через бязевое полотно, затем через мембранные фильтры с диаметром пор 0,8 мкм, в качестве адсорбента используют высокопористую неполярную смолу неионного характера, представляющую собой сополимер стирола с дивинилбензолом, а элюцию проводят водным раствором ацетона с градиентом 10 в диапазоне концентраций 20 50%