ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 1999 года по МПК C07K5/37 A61K38/05 

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым пептидным структурам, обладающим иммуномодулирующими свойствами, и препаратам на их основе.

Известно применение в медицине большого количества иммуностимуляторов, таких как препараты жень-шеня и лимонника, производные никотиновой кислоты, тималин и т.д. /Машковский М.Д. Лекарственные средства, т. 11, М.: Медицина, 1988 г., стр. 169/. Недостатки большинства природных препаратов - невысокая активность в связи с низким содержанием активного начала, наличие побочных эффектов.

Известно значительное количество иммуностимуляторов пептидной природы, например, тактивин /пат. Франции N 2570278, кл. A 61 K 39/41, тимозин /Goldstein A.L. et.al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1856-1863/, полученных из природного сырья. Эти препараты представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на ряд других физиологических функций организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов. Кроме того, практическое использование таких препаратов затруднено в связи со сложностью способов их извлечения из природного сырья, малым выходом, значительной вариабельностью их физико-химических свойств.

Поиск синтетических пептидов с селективной активностью на счет изменений структуры представляется более целесообразным. Синтетическими пептидными иммуностимуляторами являются пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH /пат. США N 4478828, кл. A 61 K 37/00, C 07 C 103/52, 1984 г./, аналоги тимопентина /Евр. пат. N 1450798, кл. C 07 K 7/64, 1985 г., пат. США N 5013723, кл. A 61 K 37/02, 1991 г./ и т.п.

Еще больший интерес представляет создание пептидных иммуностимуляторов на основе коротких, селективно действующих высокоактивных пептидов, синтез которых является экономически выгодным.

Прототипом заявляемого изобретения являлся препарат тимоген на основе пептида структуры H-α-L-Glu-L-Trp-OH, недостатком которого является менее высокая иммуномодулирующая активность.

Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящей группы изобретений, являлась разработка более эффективного и безопасного иммуномодулирующего препарата на основе коротких пептидов. Настоящее изобретение является продолжением и дальнейшим развитием работ, связанных с препаратами группы "Бестим" и описанных в заявках о выдаче патента N 95119704 от 29.11.95 и N 95120266 от 06.12.95. При этом, в частности, был получен препарат-иммуномодулятор на основе пептида, имеющего химическую структуру H-γ-L-Glu-L-Trp-OH, более перспективный, чем тимоген.

Было найдено, что поставленная выше задача решается путем использования хотя бы одного из пептидов общей формулы:

где n = 1, 2,
R: H, низший ацил или низший алкил,
X: ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное, например, эфир, амид, гидразид и т.д.

Пептиды получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе /J.M. Steward and J.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969/ или путем синтеза в растворе /E.Schroder and K.Lubke, "The Peptides", Vol.I, Academic Press (New York), 1965/ с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.

В качестве промежуточной защиты α-аминогруппы аминокислот при твердофазном методе синтеза используют трет-бутилоксикарбонильную группу. Для защиты боковых радикалов аминокислот используют следующие группы: для гистидина бензилоксиметильную; для тирозина - 2,6-дихлор-бензильную; для триптофана - формильную и т. д. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или диизопропилкарбодиимид или те же конденсирующие агенты с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Деблокирование ведут 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в хлористом метилене.

Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью безводного фтористого водорода, а очистку гель- и обращенно-фазовой хроматографией.

На базе пептидов был получен препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью следующего состава, мас.%: пептид - 0,001-0,01; служебные добавки - 99,99-99,999. В качестве служебных добавок в зависимости от формы введения препарата могут быть использованы растворы, содержащие 0.9% NaCl, 0.5% новокаин для внутривенного и внутримышечного введений, или крахмал, глюкоза, глицин и их смеси для перорального применения.

Получение лекарственного препарата осуществляют по стандартным технологиям получения лекарственных форм фармацевтических препаратов, а именно путем добавок к действующему началу фармацевтически подходящих неорганических и органических кислот, например, хлористоводородной, серной, фосфорной, уксусной, гликолевой, молочной, лимонной и т.д., их солей, неорганических и органических оснований и соответствующего растворителя, не вызывающего нежелательных побочных эффектов, таких, например, как желудочно-кишечные дискомфорты, лихорадки и т.п.

Действие новых препаратов оказалось наиболее эффективным для лечения вторичных иммунодефицитов, развивающихся, например, у больных с хирургической инфекцией и онкологических больных. Под влиянием препарата наблюдается значительное усиление экспрессии θ-антигена и продукции интерлейкина-2- лимфоцитами, а также увеличение процентного и абсолютного содержания CD3 и CD4 лимфоцитов.

Препараты нетоксичны, так как при 1000-кратном превышении терапевтической дозы (1 мг/кг) летальный исход не был обнаружен ни у одного животного.

Практическая применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез γ-D-глютамил-L-триптофана (I).

0.74 г (0.002 моль) α-бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-глютаминовой кислоты растворяют в 12.0 см³ сухого тетрагидрофурана, прибавляют 0.22 мл (0.002 моль) N-метилморфолина и охлаждают до -15^oC. После добавления 0.28 мл (0.002 моль) изобутилхлорформиата реакционную смесь перемешивают в течение 3 мин при -10^oC и добавляют охлажденный раствор 0.93 г (0.002 моль) пара-толуолсульфоната бензилового эфира L-триптофана и 0.22 мл (0.002 моль) N-метилморфолина в 15 мл тетрагидрофурана. Полученный раствор перемешивают в течение 12 ч при 4^oC, фильтруют, промывают 20 мл тетрагидрофурана и упаривают. Остаток растворяют в 50 мл этилацетата, промывают равными объемами воды, 2N серной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия и вновь водой. Раствор высушивают над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме до объема 10 мл. Дибензиловый эфир N-бензилоксикарбонил γ-D-глютамил-L-триптофана выпадает при добавлении 50 мл гексана.

Выход: 820 мг (62%). Rf(A, хлороформ : метанол : уксусная кислота = 90: 8:2): 0.75.

Раствор 0.6 г (0.0009 моль) дибензилового эфира N- бензилоксикарбонил γ-D-глютамил-L-триптофана в 30 мл метанола гидрируют водородом над палладиевым катализатором (10%, 200 мг) в течение 5 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают досуха. Полученное масло растворяют в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30%-ного ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и лиофилизируют. Содержание основного вещества в целевом продукте по данным оптической плотности не менее 97%.

Выход: 190 мг. Rf (B, 2-пропанол : 25% NH₄OH : вода = 50:5:15): 0,5; Rf (C, бутанол : уксусная кислота : вода = 3:1:1): 0.45.

Структура подтверждается данными аминокислотного анализа гидролизата пептида и данными ЯМР. Анализ гидролизата пептида, полученного в результате гидролиза в 3N пара-толуолсульфокислоте, выявил следующее соотношение аминокислотных остатков: Glu - 1.0 (1); Trp - 0.9(1). В протонном и углеродном спектрах ЯМР (Brucker СРХ-300) обнаружены следующие сигналы (см. табл. 1, 2).

Пример 2. Синтез-γ-L-глютамил-D-триптофана (II).

0.99 г (0.0026 моль) α-бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-глютаминовой кислоты растворяют в 96.0 см³ диметилфорамида, прибавляют 0.3 г (0.0026 моль) N-оксисукцинимида, охлаждают до минус 5^oC и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0.56 г (0.0027 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 3.0 см³ диметилформамида. Смесь перемешивают при 0^oC 1 ч и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, прибавляют к фильтрату 0.64 г (0.0031 моль) D-триптофана и 0.46 см³ (0.0033 моль) триэтиламина и перемешивают реакционную смесь 16 ч при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50.0 см³ воды и экстрагируют три раза 20 см³ этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20.0 см³ воды, два раза по 20.0 см³ 2N серной кислоты, два раза по 20.0 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием. Растворитель удаляют в вакууме до объема 10 мл. Бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил γ-L-глютамил-D-триптофана выпадает при добавлении 50 мл гексана.

Выход: 1,2 г (81%). Rf(A): 0.7.

Раствор 0.6 г (0,0009 моль) бензилового эфира N-бензилоксикарбонил γ-L-глютамил-D-триптофана в 30 мл метанола гидрируют водородом над палладиевым катализатором (10%, 200 мг) в течение 5 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают досуха. Полученное масло растворяют в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30%-ного ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте и лиофилизируют. Содержание основного вещества в целевом продукте по данным оптической плотности не менее 97%.

Выход: 180 мг. Rf(B): 0,5; Rfc: 0.45.

Пример 3. Синтез β-D-aспартил-L-триптофана (III).

Для синтеза пептида β-D-аспартил-L-триптофана (загружают в реакционный сосуд 0.1 г трет-бутилоксикарбонил-N_in-формил-L-триптофил-полимера. Содержание триптофана 0.70 ммоль/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (см. табл. 3).

Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5.

Для синтеза пептида в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α-бензиловый эфир N- третбутилоксикарбонил-D-аспарагиновой кислоты.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы, 0.1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 0.1 мл тиоанизола и 0.1 мл метакрезола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 5 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 60 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.

После обработки 0.2N гидроокисью натрия пептид обессоливают на колонке с Sephadex G-10 и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30% ацетонитрила в 0.1%-ной трифтоpуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 4. Синтез β-L-аспартил-L-триптофана (IV).

Синтез пептида (IV) осуществляется теми же способами, что и пептида (III) из примера 3, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α- бенэиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-L- аспарагиновой кислоты. Строение вещества доказывается условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 5. Синтез N-метил-γ-D-глютамил-L-триптофана (V).

Синтез пептида (V) осуществляется теми же способами, что и пептида (III) из примера 3, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α- бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-N-метил-D-глютаминовой кислоты.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 0.1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 6.5 мл диметилсульфида, 0.8 мл метакрезола и 0.4 мл этандитиола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 2.5 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 120 мин, затем отгоняют фтористый водород и диметилсульфид. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.

После обработки 0.2N гидроокисью натрия пептид обессоливают на колонке с Sephadex G-10 и очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте 10-30%-ного ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97%. Строение вещества доказывается условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 6. Синтез N-ацетил-γ-D-глютамил-L-триптофана (VI).

Синтез пептида (VI) осуществляется теми же способами, что и пептида (III) из примера 3, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α- бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил D- глютаминовой кислоты. Дипептидил-полимер обрабатывают 50%-ной трифторуксусной кислотой в хлористом метилене (2 раза, 2 и 30 мин), промывают хлористым метиленом (4 раза, по 2 мин) и инкубируют в смеси, содержащей 0.11 мл триэтиламина, 0.28 мл уксусного ангидрида и 5 мл хлористого метилена. По завершении реакции пептидил-полимер промывают хлористым метиленом (6 раз по 2 мин), высушивают в вакууме, деблокируют и очищают, как указано в примере 4 (пептид IV). Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96%. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Пример 7. Синтез γ-D-глютамил-L-триптофил-амида (VII).

Синтез, деблокирование, очистка и характеристика пептида осуществляются теми же способами, что и пептида (III) примера 3, за исключением того, что в реакционный сосуд загружают 0.15 г третбутилоксикарбонил-N_in-формил-триптофилметилбензгидриламинополимера, на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют α-бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты и выдерживают реакционную смесь при деблокировании в среде безводного фтористого водорода в течение 2 ч. Содержание формил-триптофана - 0.5 ммоль/г полимера.

Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97%. Строение вещества доказывалось условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.

Иммуномодулирующая активность заявляемых пептидов оценивалась по их способности влиять на уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов θ-антигена и пролиферацию тимоцитов, по их влиянию на индукцию синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2 и способности активировать функциональный ответ лейкоцитов.

Пример 8. Влияние пептидов на дифференцировку предшественников T-лимфоцитов костного мозга, мышей (in vitro).

Взвесь клеток костного мозга мышей, умерщвленных дислокацией шейных позвонков, получают путем промывания бедренных костей физиологическим раствором. Пептиды в различных концентрациях добавляют к полученным клеткам в среде Игла и инкубируют в течение 1 ч при 37^oC. Уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов θ-антигена определяют методом комплемент зависимого цитолиза с помощью антител к θ-антигену /Terasabi - P.I. et al. In Manual of Tissue Typing Techniques, National Institute of Health, Bethesda, 1972, p. 50-55/. Данные приведены в табл. 4.

Пример 9. Влияние пептидов на продукцию ингерлейкина-2 мышиными спленоцитами.

Данные по влиянию пептидов на индукцию синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2 /Gillis S.et al., J.Immunol., 1978, v.120, p. 2027-2032/ приведены в табл.5.

Пример 10. Влияние пептидов на фагоцитоз лейкоцитов человека.

Нейтрофилы, выделенные из крови донора центрифугированием в градиенте плотности, переносили в пробирки, обработанные силиконом и содержащие среду Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Конечная концентрация клеток составила 2•10⁶ в мл. После добавления опсонизированных человеческой сывороткой дрожжевых клеток (из расчета 10 клеток на 1 нейтрофил) клеточная суспензия помещалась в CO₂ инкубатор на 40 мин. Клетки отмывали центрифугированием, наносили на стекло и окрашивали по методу Гимза. Количество фагоцитировавших клеток оценивалось визуально под микроскопом. Результаты представлены в табл. 6.

Пример 11. Влияние пептидов на хемотаксис лейкоцитов человека.

Влияние пептидов на хемотаксис лейкоцитов было оценено в тесте миграции под агарозой по Nelson et al. (1972). Агарозу растворяли в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до концентрации 1% и переносили в чашки для тканевых культур. После образования геля прорезались лунки диаметром 2 мм на расстоянии 3 мм друг от друга. В центральные лунки вносили по 10 мкл среды, содержащей 2.5•10⁴ нейтрофилов. Для оценки спонтанной миграции лунки, оставшиеся с одной стороны, заполняли средой, не содержащей пептидов. Для оценки стимулированной миграции лунки с противоположной стороны заполняли средой, содержащей FMLP в концентрации 10^-7 М. Чашки помещались в CO₂ инкубатор на 120 мин. Исследуемые пептиды добавляли в центральные лунки вместе с лейкоцитами. Клеточная миграция оценивалась под микроскопом и выражалась в виде хемотактического индекса (стимулированная миграция/спонтанная миграция, см. табл. 7).

Пример 12. Влияние пептидов на пролиферацию тимоцитов крыс.

Тимоциты, полученные из тимусов белых беспородных крыс, культивировали в присутствии различных концентраций тестируемых пептидов в течение 72 ч в CO₂ инкубаторе в 96-луночных плоскодонных культуральных микропланшетах (Флоу) в среде Игла с добавлением 1% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 80 мкг/мл гентамицина и 5 мкг/мл полимиксина В. В качестве индуктора пролиферации использовали конканавалин А в концентрации 0,5 мкг/мл. На последние 16 ч культивирования в среду вносили ³H-тимидин. После окончания культивирования клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью автоматического харвестера. Количество включенного ³H-тимидина оценивали в сцинтилляционном В-счетчике и выражали в импульсах в 1 мин. Результаты представлены в табл. 8.

Пример 13. Получение препарата на основе пептидов.

Препарат получали по стандартным методикам получения лекарственных препаратов ("Технология лекарственных форм", под ред. Л.А.Ивановой.- М.: Медицина, 1991). Инъекционная форма содержит 0,1 мг пептида, растворенные в 1 мл стерильного физиологического раствора. Таблетки, применяемые перорально, имеют следующий состав: 0,1 мг пептида, 98,9 мг глицина, 1 мг стеарата магния.

Пример 14. Влияние препарата γ-D-глютамил-L-триптофана на продукцию интерлейкииа-2 (in vivo).

По методике примера 13 препарат был приготовлен в виде инъекционной формы с содержанием пептида в дозах от 10,0 до 0,00001 мкг/мл. Полученные растворы вводили мышам перорально. Группа из 5 животных была использована для каждой исследованной дозы. Через 24 ч животные были умерщвлены, селезенки удалены и спленоциты инкубировались дополнительные 24 ч в присутствии конканавалина А (5 мкг/мл). Уровень интерлейкина-2 в культуральной жидкости оценивался в по степени влияния на пролиферацию интерлейкин-2-зависимой клеточной линии CTLL-2. Результаты эксперимента представлены в табл. 9.

Пример 15. Использование препарата γ-D-глютамил-L- триптофана для коррекции иммунодефицита у онкологических больных.

А. Больной Е-в, 56 лет, находился в ГКБ N 26 г. Санкт-Петербурга с диагнозом "Рак толстой кишки". У больного отмечено иммунодефицитное состояние, развившееся на фоне основного заболевания. Препарат применен в виде курсовой терапии (пять ежедневных приемов таблеток, содержащих 0.1 мг натриевой соли пептида) через 1 месяц после радикального хирургического вмешательства. Результаты лечения приведены в табл. 10.

Б. Больной А-н, 67 лет, находился в ГКБ N 26 г. Санкт-Петербурга с диагнозом "Рак толстой кишки". У больного отмечено иммунодефицитное состояние, развившееся на фоне основного заболевания. Препарат применен в виде курсовой терапии (пять ежедневных приемов таблеток, содержащих 0.1 мг натриевой соли пептида) через 1 месяц после радикального хирургического вмешательства. Результаты лечения приведены в табл. 11.

Описывается новый пептид общей формулы I, где R=H, низший алкил или низший ацил, X - гетероароматическая аминокислота, n=1,2, причем, если остаток RNCH(COOH)(CH₂)_nCO- - остаток глютаминовой кислоты (n=2), то X имеет стереоконфигурацию, отличную от стереоконфигурации α-углеродного атома глютаминовой кислоты, обладающей иммуномодулирующей активностью. Описывается также препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью, содержащий пептид и служебные добавки, причем в качестве пептида используется соединение общей формулы I, где значения R и X указаны выше, при следующем соотношении ингредиентов, мас. %: пептид 0,001 - 0,01, служебные добавки - остальное. 2 с.п. ф-лы, 11 табл.

1. Пептид общей формулы

n = 1, 2;
R - водород, низший ацил или низший алкил;
X - гетероароматическая аминокислота, причем, если остаток

- остаток глютаминовой кислоты (n = 2), то X - имеет стереоконфигурацию, отличную от стереоконфигурации α- углеродного атома глютаминовой кислоты, обладающей иммуномодулирующей активностью. 2. Препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью, содержащий пептид и служебные добавки, отличающийся тем, что в качестве пептида содержит вещество общей формулы

n = 1, 2;
R - водород, низший ацил или низший алкил;
X - гетероароматическая аминокислота, причем, если остаток

- остаток глютаминовой кислоты (n = 2), то X - имеет стереоконфигурацию, отличную от стереоконфигурации α- углеродного атома глютаминовой кислоты, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
Пептид - 0,001 - 0,01
Служебные добавки - Остальное