СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДОВ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 1997 года по МПК C07J5/00 C07J7/00 C12P33/00 

Изобретение касается производства кортикостероидов, получаемых микробиологическим путем в присутствии природных или синтетических полимеров, позволяющих повышать нагрузку стероида до 10 15 г/л.

Более конкретно оно относится к способу выделения Δ^1,4-3-кетостероидов (II) или 11β-оксипроизводных кортексолона (IV) из культуральной жидкости процессов микробиологического дегидрирования или гидроксилирования, проходящих в присутствии циклодекстрина (ЦД) или термообратимых полимеров, таких как гомо- и сополимеры N-винилкапролактама (в частности поливинилкапролактам
ПВК).

Упомянутые процессы могут быть выражены схемами:

где
R₁=H, R₂=OH, R₃=H, R₄=H или
R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=Ac, R₄=H или
R₁=CH₃, R₂=OH, R₃=H, R₄=H или
R₁=H, R₂=O, R₃=H, R₄=OH
или

где
R'=R''=H; R'=R''=Ac; R'=H, R''=Ac
Хорошо известно, что после осуществления процесса микробиологической трансформации важнейшим моментом является нахождение способа выделения целевого продукта из культуральной жидкости, причем такого, который был бы достаточно прост, позволял бы получать этот продукт высокого качества и без потерь, и достаточно безопасен, чтобы мог быть осуществлен в производстве таких ценных препаратов, как кортикостероиды.

Ранее выделение продуктов микробиологической трансформации проводилось, как правило, с использованием экстракций большими объемами органических растворителей со всеми вытекающими отсюда последствиями.

Наиболее близким к заявленному способу (и наиболее прогрессивным) является способ выделения стероидов (на примере Δ^1,4-3-кетостероидов) из культуральной жидкости, полученных в процессе микробиологического дегидрирования в присутствии циклодекстрина (ЦД) (патент Венгрии A 176250). Этот метод основан на выделении полученных стероидов из культуральной жидкости (там они находятся в виде молекул включения с ЦД) с использованием процесса экстракции большими объемами органических растворителей (таких как этилацетат). Растворитель берется в 250-кратном избытке по отношению к стероиду. Полученный экстракт затем упаривают до половины объема, осветляют активированным углем, обрабатывают цеолитом и снова упаривают до начала кристаллизации. Полученную суспензию выдерживают несколько часов при 5 - 10^oC, отфильтровывают стероид и из фильтрата обработкой пятикратным количеством диизопропилового эфира дополнительно выделяют целевой продукт. Суммарный выход 93,7% при 98%-ной степени чистоты. Используемый в микробиологической реакции ЦД регенерируют из жидкости, полученной после экстракции этилацетатом. Для этого жидкость перемешивают с циклогексаном в течение 1 ч, затем выпавший осадок отфильтровывают, суспензируют в воде и циклогексан отгоняют с паром. Оставшуюся водную суспензию ЦД выдерживают 12 ч при температуре от 5 до 10^oC и только потом выделяют ЦД. Степень регенерации 55%
Нетрудно видеть, что описанный способ прежде всего весьма трудоемок. Кроме того, он содержит целый ряд серьезных недостатков:
необходимость использования огромных количеств растворителя и специального оборудования (экстракторов и испарителей);
энергоемкость, обусловленная использованием большого количества растворителей;
длительность процесса;
загрязнение окружающей среды вследствие больших фактических потерь этилацетата;
невозможность полной и достаточно простой регенерации дорогостоящего ЦД.

Кроме того, этот способ не может быть отнесен к другим вариациям микробиологической трансформации, не предусматривающим, например, обязательного использования циклодекстрина, что не дает возможным считать его универсальным.

В частности, он не может быть использован в случае применения синтетических полимеров в связи с тем, что последние растворяются в используемых для извлечения стероида растворителях. В результате этого становится невозможным выполнение основной цели, а именно разделения стероида и использованного для повышения нагрузки полимера.

Поэтому целью изобретения явилось создание нового оригинального способа выделения стероидов из культуральной жидкости микробиологической трансформации в присутствии природных или синтетических полимеров, таких как ЦД или ПВК, который был бы достаточно прост, безопасен с точки зрения его экологической характеристики, и, что крайне важно, давал бы при этом возможность повысить выход целевого продукта при сохранении его высокого качества.

Эта цель достигнута нами тем, что культуральную жидкость после микробиологической трансформации стероида в любой концентрации в присутствии упомянутых полимеров вводят в контакт с высокопористым полимерным сорбентом, таким как поролас, и адсорбированный на этом сорбенте стероид элюируют полярным органическим растворителем. Из полученного элюата целевой продукт выделяют упариванием и фильтрацией.

Следует подчеркнуть, что для выполнения поставленной цели необходимо было найти именно такой сорбент, который бы разрушал связь стероид-полимер, избирательно задерживал стероидный продукт и полностью пропускал полимерный, а в случаях проведения трансформации мицелием снимал стероид с мицелия на себя. Сведений в литературе на эту тему не имелось. Нам пришлось исследовать ряд гидрофобных сорбентов, которые могли бы обладать этой способностью. Среди них наиболее подходящим и отвечающим всем предъявляемым требованиям оказались неполярные макросетчатые высокомолекулярные синтетические смолы, выпускаемые нашей промышленностью под названием поролас.

Высокопористые неионогенные полимеры-сорбенты "поролас" представляют собой полистирол, полученный сополимеризацией дивинилбензола и этилстирола в присутствии модифицирующих добавок, таких как винилацетат, акриловый эфир, метакриловая кислота.

Указанные сорбенты характеризуются большой удельной поверхностью 500 - 1000 м²/г со значительным объемом пор больше 1 см³/г и неполярными или слабополярными свойствами. Сорбенты "поролас" отличаются высокой механической прочностью и стабильностью в работе в циклах сорбции-десорбции.

В табл. 1 представлены физико-химические характеристики сорбентов "поролас" различных типов.

Лучшие результаты по выделению стероидов из культуральной жидкости получены на пороласе типа СГ, при многократном его использовании. Введение в контакт с высокопористым полимерным сорбентом может быть осуществлено различными путями это и перемешивание культуральной жидкости с упомянутым сорбентом с последующим последовательным пропусканием через фильтр и элюированием; это и пропускание культуральной жидкости через колонку, предварительно наполненную оговариваемым сорбентом, также с последующим элюированием.

Следует отметить лишь то, что лучшие результаты в случае выделения Δ⁴-3-кетостероидов были достигнуты именно при использовании "колоночного" метода (количество сорбента не менее, чем 10-кратное к весу стероида), причем для элюирования особенно пригоден ацетон или низш. спирт (желательно в 50 - 75-кратном количестве к весу стероида), а в случае выделения продукта 11b-гидроксилирования культуральную жидкость предпочтительнее перемешивать с сорбентом (взятым в количестве не менее 8-кратного к весу стероида) с последующей фильтрацией и элюированием лучше всего этилацетатом. В этом случае при перемешивании достигается максимальный контакт мицелия с сорбентом, что позволяет более полно извлечь продукт 11b-гидроксилирования.

Достоинством нашего метода является и возможность регенерации используемых для трансформации полимеров, что особенно важно при перенесении метода на производственные площади.

Методы регенерации достаточно просты. Так, при проведении трансформации с термополимерами (например ПВК) регенерация проводится нагреванием культуральной жидкости после пропускания ее через колонку с сорбентом до 80 90^oC. При этом термополимер высаживается, а жидкость отделяется декантацией. Для очистки термополимер переосаждают из воды. Далее термополимер может повторно использоваться для трансформации. Степень регенерации полимера 90 95% При работе с циклодекстрином для его регенерации к культуральной жидкости после сорбции из нее стероида прибавляют 10% (к объему культуральной жидкости) хлороформа и перемешивают во времени. Выпавший циклодекстрин отфильтровывают, сушат. Степень регенерации циклодекстрина 85% При проведении микробиологической трансформации с использованием регенерированных термополимера и циклодекстрина выход и качество целевого продукта не изменяются.

Заявляемый способ подтвержден и проиллюстрирован рядом экспериментальных данных, сведенных в прилагаемой табл. 2. А для удобства предлагаем общие методики выделения стероидов из культуральной жидкости, с помощью которых и осуществлена экспериментальная часть. Также подробно приводим два примера выделения преднизолона и гидрокортизона по методикам N 1 и N 3 соответственно.

Методика 1.

Культуральную жидкость после проведения процесса микробиологического дегидрирования в присутствии природного или синтетического полимера пропускают через колонку с высокопористым полимерным сорбентом типа поролас, содержащую предпочтительно 10-кратное (к весу стероида) количество сорбента. По завершении пропускания раствора через сорбент колонку тщательно промывают водой для снятия остаточных количеств полимера и затем стероид элюируют ацетоном, этилацетатом или низшим спиртом.

Колонка может быть использована для выделения многократно (не менее 10 раз) при условии поддержания ее во влажном состоянии.

Элюат упаривают в вакууме и отфильтровывают. Промывают гексаном, сушат.

Методика 2.

К культуральной жидкости после проведения процесса дегидрирования с применением упомянутых полимеров прибавляют высокопористый полимерный сорбент поролас (предпочтительно в 7-10-кратном количестве по отношению к весу стероида) и перемешивают некоторое время. Сорбент отделяют фильтрацией, промывают водой, отжимают. Стероид с сорбента элюируют растворителем, указанным в методике 1. Далее выделяют, как в методике 1.

Методика 3.

К культуральной жидкости, содержащей мицелий и стероид, по окончании процесса гидроксилирования прибавляют сорбент поролас (предпочтительно 8 - 10-кратное к весу стероида количество) и перемешивают во времени. Сорбент отделяют фильтрацией, промывают водой, отжимают и стероид извлекают предпочтительно этилацетатом.

Продукт гидроксилирования выделяют из остатка после упаривания растворителя.

Мицелий можно отделять фильтрацией и извлекать стероид с него и из культуральной жидкости отдельно.

Пример 1. Выделение преднизолона из культуральной жидкости процесса дегидрирования.

Культуральную жидкость в количестве 200 мл после окончания процесса микробиологического дегидрирования в присутствии поли-N-винилкапролактама, содержащую 1 г стероида, пропускают через колонку с 10 г высокопористого полимерного сорбента типа поролас СГ-17/91. По завершении пропускания раствора колонку промывают 50 мл воды, остатки воды отсасывают вакуумом. Затем через колонку пропускают 50 мл ацетона. Ацетон упаривают в вакууме досуха. К остатку прибавляют 5 мл гексана. Осадок отфильтровывают, промывают гексаном. Сушат. Получают 0,98 г (выход 98%) преднизолона с содержанием остаточного гидрокортизона менее 2%
Пример 2. Выделение гидрокортизона из культуральной жидкости процесса 11b-гидроксилирования.

К 200 мл культуральной жидкости с мицелием, содержащей 1 г гидрокортизона, по окончании процесса 11b-гидроксилирования в присутствии циклодекстрина прибавляют 8 г пороласа T и встряхивают на качалке в течение 4 ч. Сорбент с мицелием отделяют фильтрацией, промывают водой, отжимают и заливают 75 мл этилацетата. Встряхивают на качалке 2 ч. Затем этилацетат декантируют и из остатка после упаривания выделяют гидрокортизон. Выход 70% с содержанием примесей около 3%
Таким образом, нами впервые найден новый, неизвестный ранее (и не вытекающий из уровня техники) способ выделения стероидов из культуральной жидкости процесса микробиологической трансформации в присутствии природных или синтетических полимеров, таких как ЦД или ПВК. Этот способ благодаря его универсальности, простоте, высоким качественным и количественным показателям может быть применен в промышленном производстве таких ценных гормональных препаратов, как преднизолон, гидрокортизон, метилпреднизолон и др.

Использование: биотехнология, фармацевтическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: способ выделения кортикостероидов из культуральной жидкости после микробиологической трансформации с помощью высокопористого полимерного сорбента в присутствии природных или синтетических полимеров, причем элюцию стероида с сорбента осуществляют полярным органическим растворителем. Из полученного элюата целевой продукт выделяют упариванием и фильтрацией. Способ позволяет повысить выход целевого продукта с одновременным упрощением технологии выделения. 6 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ выделения кортикостероидов из культуральной жидкости после микробиологической трансформации в присутствии природных или синтетических полимеров, включающий стадии упаривания и фильтрации, отличающийся тем, что культуральную жидкость вводят в контакт с высокопористым полимерным сорбентом, таким как поролас, адсорбированный на сорбенте стероид элюируют полярным органическим растворителем и из полученного элюата целевой продукт выделяют упариванием и фильтрацией. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве природных или синтетических полимеров берут циклодекстрин или гомо- и сополимеры N-винилкапролактама соответственно. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве гомо- и сополимера N-винилкапролактама берут поливинилкапролактам или его сополимер с винилацетатом или N-винил-N- метилацетамидом с молекулярными массами от 100 до 1000000. 4. Способ по пп. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что в случае выделения Δ⁴-3- -кетостероида культуральную жидкость пропускают через слой сорбента в количестве не менее чем 10-кратном к весу стероида, например, с использованием колонки, а элюирование ведут с помощью ацетона или низшего спирта в качестве полярного растворителя. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что ацетон или низший спирт берут в количестве 50 75 кратном по отношению к весу стероида. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость перемешивают с сорбентом, взятом в количестве не менее 8-кратного по отношению к весу стероида. 7. Способ по п. 4 или 6, отличающийся тем, что в случае выделения II β-оксипроизводных в качестве элюата используют этилацетат.