СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ПЕСТИЦИДА 2,4-Д Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области здравоохранения, экологии и может быть использовано при определении степени безопасности пестицида 2,3-дихлорфеноксиуксусный кислоты (2,4-D).

В современном здравоохранении по существующему положению все используемые пестициды оценивают по степени их безопасности. При этом анализируют свободные формы препаратов либо их производные (см. Справочник по пестицидам ( Н.Н.Мельников и др.-М.Химия,1985.-352 с.)
Данный способ оценки безопасности пестицидов не позволяет получить достоверные данные по биологической активности препаратов, поскольку работами ряда исследователей показано, что значительная часть (около 50%) пестицидов в почве, в растениях и в организме животных находится в связанном виде (см. Khan S.U. Hanulton H.A. J. Agric. Jood. Chem. 1980.-28.-P.126. Chin W. J. Kucharczyk N. Smith A.E. J.Agric. Food. Chem.1973.-21.-P.506. Wargo J.P. Honeycutt R.C. Adler J.Z. J.Agric.Food.Chem.1975.-23.-P.1095. Caprid P. Haisch A.Khan S.U. J.Agric. Food. Chem.1975.-33.-P.567).

Вопросы биологической эффективности (пригодности) связанных форм пестицидов освещались лишь в некоторых работах. Сообщалось, что растения люцерны, содержащие связанные формы профамфенила, оказались биологическими малоэффективными, т.к. 86% дозы препарата удалялось с фекалиями (см. Paulson G.D. Jasobsen A. M. Still G.G. Pestic. Biochem. Physiol. 1975.-5.-P.523). Были проведены исследования биологической пригодности связанных форм ¹⁴C-пропанил-фенила, находящихся в рисовых растениях, используемых для откорма белых крыс (см. Sutherland M.L. Amer. Chem. Soc. Symp. Ser. 1976.-29.-p. 153). Из этих работ было сделано заключение, что связанные формы пропанилфенила могут рассматриваться как нетоксичные.

Совместное подразделение ФАО/МАГАТЭ в 1986 г. только приступило к реализации программы, направленной на изучение биологической активности и биологической доступности связных форм пестицидов.

Известен способ по определению токсикологического действия чистого 2,4-D, т.е. свободной формы пестицида, (см. Лебедева С.Н. Влияние пестицидов 2,4-D и карбофоса на иммунологическую реактивность организма животных. Дисс. на соиск. канд. биол. наук, М. 1990. 151 с.), с помощью которого показано, что 2,4-D оказывает иммунодепрессивное дозозависимое влияние на организм животных.

Имеются данные о влиянии производных 2,4-D на организм животных (см. Цыремпилов П.Б. Действие 2,4-D диметиламмониевой соли на иммунобиологическую реактивность организма животных. Дисс. на соиск. канд. вет. наук, Казань, 1987. 169 с.)
Как отмечает в работе Гирис Д.А. (Естественная резистентность у скота при отравлении 2,4-D. Ветеринария, 1978, N 9, с. 93-94) бутиловый эфир 2,4-D снижают бактерицидную активность сыворотки крови, фагоцитарную активность.

Аминная соль 2,4-D также оказывает подобное действие (см. Кенигсберг Я. Э.Действие пестицидов на иммунную систему организма животных и основы профилактики иммунологической недостаточности. Дисс. докт. биол. наук, Минск, 1980).

Все указанные выше технические решения для оценки безопасности пестицидов предусматривают исследование только свободной формы препарата. А решений по оценке биологической активности связанных форм 2,4-D нет. Хотя известно, что препараты данной группы проявляют сильную тенденцию к образованию связей (см. Федорова Л.М. Белова Р.С. Производные хлорфеноксиуксусных кислот и охрана окружающей среды. Изд-во Саратовского университета, 1983, с.96).

Сущность заявляемого технического решения заключается в исследовании связанной формы 2,4-D для оценки биологической активности пестицидов. При проведении экспериментальных исследований было обнаружено, что связанные формы 2,4-D более токсичны, чем свободные, хотя считалось, что связанные формы нетоксичны.

При осуществлении изобретения достигается новый технический результат, заключающийся в получении более достоверной и точной оценки безопасности пестицида, обеспечивающий высокое качество способа. Для достижения указанного технического результата в способе оценки безопасности пестицида 2,4-D, предусматривающем исследование токсикологического действия свободной формы препарата, согласно изобретению проводят исследование связанной формы препарата и оценку производят по сочетанному эффекту свободной и связной форм препарата.

Введение в предлагаемую совокупность новых приемов, а именно исследования токсикологического действия связанной формы пестицида и оценки безопасности препарата по сочетанному эффекту двух форм 2,4-D позволил получить наиболее точную и достоверную оценку биологической активности пестицида. Все известные способы оценки безопасности пестицида не позволяют получить указанный выше технический результат, т.к. оказалось, что связанная форма пестицида оказывает более токсическое действие на биологические объекты, чем свободная форма. И только учитывая сочетанный эффект токсикологического действия свободной и связанной форм пестицида можно получить точную оценку безопасности пестицида.

Таким образом, существенные отличительные признаки изобретения позволяют получить по сравнению с известными способами высокий технический результат, приводящий к повышению качества способа.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами, подтверждающими возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Определение токсичности конъюгированных форм пестицида на инфузории Tetrachimena pyriformis
Исследованы токсикологические свойства конъюгатов 2,4-норлейцин и 2,4-D-казеин в диапазоне концентраций 0,0075 мкг/мл 75 мкг/мл.

Морфологическая и количественная характеристика популяций T. pyriformis под влиянием препаратов дана в табл. 1. Токсикологическая характеристика конъюгата 2,4-D-норлейцин в концентрации 7,5 мкг/мл представлена на фиг. 1, где изображена диаграмма изменения численности инфузорий под влиянием связанной и свободной форм 2,4-D в концентрации 7,5 мкг/мл при инкубации в течении 24 ч: по оси ординат на фиг. 1а относительные показатели численности, на фиг. 1б абсолютные показатели численности клеток. Цифрами в прямоугольниках на фиг. 1а и 1б обозначены: 1- казеин, 2 2,4-D, 3- конъюгат 2,4-D-норлейцин. Как видно из фиг. 1 токсичность 2,4-D, ковалентно связанного с норлейцином, усиливается по сравнению со свободными 2,4-D, т.е. связанная форма препарата 2,4-D обладает большей токсичностью на клетки инфузорий. При этом как видно из табл. 1 через 24 ч численность клеток под воздействием дозы 2,4-D, равной 7,5 мкг/мл, уменьшается на 73,7% а под действием конъюгата 2,4-D-норлейцин в той же концентрации численность уменьшается на 96,6% Поэтому при оценке безопасности пестицида необходимо учитывать сочетанный биологический эффект свободной и связной форм препарата, и он будет выше 96,6%
Для того, чтобы определить зависит ли токсичность связанной формы 2,4-D от соединения, с которым он связан, был синтезирован конъюгат 2,4-D-казеин. Токсикологическая характеристика его в дозе 7,5 мкг/мл представлена на фиг. 2, где изображена диаграмма изменения численности инфузорий под влиянием связанной и свободной форм 2,4-D в дозе 7,5 мкг/мл при инкубации в течение 24 ч: на фиг. 2а относительные показатели численности, на фиг. 2б- абсолютные показатели численности клеток. Цифрами в прямоугольниках обозначены: 1- казеин, 2- 2,4-D, 3- конъюгат 2,4-D-казеин. Как видно из фиг.2, токсичность конъюгированной формы 2,4-D больше, чем свободной 2,4-D. При этом численность клеток при воздействии 2,4-D уменьшается на 82% а под воздействием конъюгата 2,4-D-казеин на 87,4% Т.е. сочетанный эффект свободной и связанной форм в данном случае будет выше 87,4%
По-видимому, решающую роль в усилении токсичности связанных форм 2,4-D играет не столько соединение, с которым связывается 2,4-D, а тип связи и те изменения, которые возникают в молекуле 2,4-D при конъюгации.

Пример 2. Определение биологической ценности конъюгата 2,4-D-казеин.

В эксперименте крысы-отъемыши весом около 40 г получали перорально конъюгат в дозах 0,001-0,1 мг/кг веса. Сравнительные данные представлены в табл. 2. У всех крысят отмечено статистически достоверное отставание в привесах относительно контроля. Привесы животных менялись в зависимости от полученной дозы. На 3-и и 7-ые сутки наблюдалась четкая обратная зависимость: чем больше доза, тем меньше привесы. Но к концу опыта разница в привесах у крысят, получавших разные дозы, сглаживается, и такой четкой зависимости от дозы не отмечается.

Из табл. 3 видно, что средняя продолжительность жизни крысят-отъемышей, получавших перорально конъюгат 2,4-D-казеин в течение 24 дней, достоверно меньше, чем контрольных животных; здесь также отмечается обратная зависимость от дозы. Средняя продолжительность жизни крысят, получавших максимальную дозу конъюгата, почти на 30% ниже, чем у контрольных животных.

В табл. 4 приведены экспериментальные данные по привесам и средней продолжительности жизни крысят, получавших перорально свободную и связанную формы 2,4-D в концентрации 0,01 мг/кг веса. Как видно из табл.4 связанная форма 2,4-D обладает большей токсичностью, чем свободная. Например, на 3-и сутки при действии 2,4-D привесы уменьшаются всего на 6,2% а при действии конъюгата 2,4-D-казеин на 43,7% Т.е. сочетанный биологический эффект свободной и связанной форм в данном случае будет не ниже 43,7% А средняя продолжительность жизни при воздействии 2,4-D уменьшается на 7,4% а при действии конъюгата на 21%
Пример 3. Определение токсикологической характеристики свободной и конъюгированной форм 2,4-D на культуре перитонеальных макрофагов мышей.

Исследована фагоцитарная активность макрофагов в отношении культуры Staph. aureus при инкубации клеток с конъюгатом 2,4-D-ЧСА (человечий сывороточный альбумин) в концентрациях 1, 10 и 100 мкг/мл. На фиг. 3 представлена диаграмма влияния конъюгата 2,4-D-ЧСА на фагоцитоз перитонеальных макрофагов мышей, где по оси абсцисс указаны дозы конъюгата (в мкг/мл), а по оси ординат А-активность фагоцитоза (в), В-интенсивность фагоцитоза (т.е. среднее количество клеток стафилокока в 1 макрофаге). На диаграмме прямоугольники отражают активность фагоцитоза, ломанная линия его интенсивность.

На фиг. 4 представлена диаграмма по изменению активности и интенсивности фагоцитоза макрофагов мышей (в относительных) при действии 2,4-D и 2,4-D-ЧСА в дозе 100 мкг/мл, где изображены А- активность фагоцитоза, В- интенсивность; прямоугольником обозначено действие 2,4-D-ЧСА, заштрихованным прямоугольником 2,4-D.

Как видно из фиг. 3 и 4, конъюгированная форма 2,4-D и по интенсивности, и по активности фагоцитоза оказывает более выраженный токсический эффект, чем свободная форма 2,4-D. Например, если активность фагоцитоза под влиянием 2,4-D в концентрации 100 мкг/мл уменьшалась по сравнению с контролем всего на 4,5% то при воздействии конъюгата 2,4-D-ЧСА в той же концентрации активность падала на 24,7% Интенсивность фагоцитоза при влиянии 2,4-D уменьшалась на 22,6% а при воздействии 2,4-D-ЧСА на 39,5% Следовательно, сочетанный биологический эффект в данном случае будет больше 40%
Использование предлагаемого способа оценки безопасности пестицида путем токсикологической оценки его свободной и связанной форм позволит получить более точную и достоверную оценку, т.к. учитывается сочетанный биологический эффект действия двух форм препарата. А поскольку при экспериментальных исследованиях выявлено, что связанные формы 2,4-D даже более токсичны, чем свободная форма препарата, данная оценка приведет к пересмотру существующих допустимых и пороговых концентраций 2,4-D в сторону их ужесточения.

Использование: в области здравоохранения и экологии. Сущность изобретения: оценку безопасности пестицида 2,4-D проводия путем определения токсичности свободной и конъюгированной форм пестицида на биологических объектах и оценку производят по их сочетанному эффекту. Способ позволяет получить наиболее точные и достоверные данные по оценке безопасности пестицида 2,4-D. 4 ил., 4 табл.

Способ определения безопасности пестицида 2,4-Д путем определения токсичности его свободной формы на биологических объектах, отличающийся тем, что дополнительно определяют токсичность на биологических объекта конъюгированных форм пестицида, а оценку его безопасности проводят по формуле
с