ПРОДУКТ, ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 1997 года по МПК A23L1/52 A61K39/39 

Изобретение относится к области медицинской и пищевой промышленности, в частности, созданию новых пищевых продуктов, повышающих защитные функции организма.

В медицинской практике в пищевой промышленности широко используется крапива двудомная. Однако, другой представитель семейства Крапивные (Urticaceal guss) крапива коноплевая (U.Cannabina), в настоящее время не включена в состав официально утвержденной Фармакопеи как лекарственное средство. В тибетской медицине крапиву коноплевую используют при водянке [1] в монгольской для лечения ран, ожогов, гнойников [2]
Задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в создании пищевых продуктов, способных повысить устойчивость организма к действию агрессивных факторов окружающей среды.

Для достижения обеспечивающего технического результата согласно изобретению крапиву коноплевую U.Cannabina применяют в качестве продукта, обладающего иммунокорригирующими свойствами.

Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что в ней отсутствуют данные о том, что крапива коноплевая обладает выраженными иммунокорригирующими свойствами, это позволяет сделать вывод о соответствии предложения критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Нами проведены эксперименты по оценке показателей иммунной системы организма животных, характеризующие состояние клеточного, гуморального иммунитета, а также функциональную активность макрофагов.

В качестве биологической модели иммунодефицитного состояния использовали животных, подвергнутых воздействию гербицида 2,4-Д. Введение гербицидов 2,4-Д животным, вызывает дозозависимое снижение показателей клеточного и гуморального иммунитета, функциональной активности макрофагов. Животным, затравленным гербицидом 2,4-Д, вводили водный экстракт крапивы коноплевой.

Экстракт готовят следующим образом: 10 г суховоздушной измельченной массы травы заливают 200 см³ кипятка, выдерживают на водяной бане 15 мин, настаивают в течение 2 ч при комнатной температуре и затем фильтруют.

Готовый экстракт вводили в количестве 0,2 см³/мышь в течение 10 дн.

Оценку иммунокорригирующих свойств проводили по изменению количества антителообразующих клеток АОК селезенки, реакции "трансплантат против хозяина" и показателей функциональной активности макрофагов (Практикум по иммунологическим методам исследования. Улан-Удэ, 1987 г.).

Определение АОК проводили методом локального гемолиза. Этот метод применяют для подсчета и изучения отдельных АОК в тех случаях, когда имеется лишь очень небольшое число их среди миллионов клеток, не образующих антител. Сущность его заключается в следующем. Лимфоидные клетки смешивают с эритроцитами и иммобилизуют в жидкой среде, помещенной в замкнутую камеру (метод Cunningham 1965 г.). Секретируемые отдельной лимфоидной клеткой антитела диффундируют вокруг нее и тут же фиксируются на антигене. В присутствии комплемента вокруг каждой антителообразующей клетки (АОК) создается зона гемолиза.

Мышей иммунизируют внутривенно (в хвостовую вену) эритроцитами барана, суспендированными в физиологическом растворе, в дозе 2•10⁸ клеток на мышь (объем введения не более 0,5 мл).

Реакцию ставят на четвертые сутки после иммунизации.

Для приготовления суспензии лимфоидных клеток извлекают селезенку от каждого животного и измельчают на холоде с помощью стеклянного гомогенизатора в однократной среде Хенкса (5 мл среды на 1 селезенку). Далее клеточную взвесь фильтруют через капроновую сеточку и разводят в 2, 10 и 20 раз. Концентрация лимфоидных клеток в суспензии должна быть такой, чтобы в наполненном объеме содержалось приблизительно 100 150 АОК на 1 предметное стекло и 200 300 на 1 чашку Петри. Содержание АОК определяют в предварительных опытах.

В качестве индикаторных клеток лучше использовать эритроциты, выдержанные в течение недели в растворе Олсвера, поскольку свежие эритроциты менее чувствительны к иммунному гемолизу. Перед приготовлением суспензии эритроциты трижды отмывают, центрифугируют по 10 мин при 3000 об/мин в среде Хенкса при комнатной температуре. Затем клетки ресуспендируют в среде Хенкса до концентрации 20% (по объему) для работы в агаровом геле и 10% для методики Каннингема.

Камеры для инкубации приготавливают из двух предметных стекол, соединенных между собой по краям парафином.

Объем камеры должен быть приблизительно равен 180 200 мкл.

В пенициллиновых флаконах готовят смесь равных объемов суспензии лимфоидных клеток, эритроцитов барана и комплемента непосредственно перед постановкой реакции. Полученную смесь разливают в стеклянные камеры, записывая объем суспензии, который входит в каждую камеру. Затем камеры помещают в лоток, инкубируют 1 2 ч при температуре 37^oC и подсчитывают зоны гемолиза с помощью микроскопа МБС-1 (ув. 12,5х1) по всей камере. Подсчет удобнее вести, когда на предметном стекле появляется не более 100 200 зон гемолиза. При осторожном обращении с камерами морфология зон гемолиза не нарушается. Подсчет зон проводят в первые 2 3 ч после их появления, так как со временем из-за перемещения клеток в жидкой среде зоны становится нечеткими.

Опытную пробу ставят в нескольких повторностях для математической обработки результатов.

Реакцию характеризуют количеством АОК на 1 селезенку или на 10⁶ клеток с ядрами.

Среди многочисленных способов экспериментального воспроизведения реакции "трансплантат против хозяина" РТПХ, модель с гибридами F занимает особое место. В соответствии с законом генетики такие гибриды не дают иммунного ответа на трансплантаты ткани от родительских линий, и это позволяет обойтись без иммунодепрессивной обработки реципиентов.

Для проведения данной реакции берут 2 линии мышей: реципиенты-мыши-гибриды первого поколения F₁ (CBAхC57Bl) и доноры клеток для гибридов мыши родительской линии CBA.

Мышей доноров CBA забивают путем цервикальной дислокации, вскрывают, стерильно извлекают селезенки. После извлечения селезенки погружают в охлажденный раствор Хенкса и освобождают от крови, жира и соединительной ткани, затем переносят в стеклянный гомогенизатор, содержащий среду Хенкса (примерно 5 см³ среды на 2 селезенки) и измельчают. Полученную взвесь клеток фильтруют через капроновую сеточку, определяют концентрацию клеток при разбавлении в 20 раз 0,5% раствором уксусной кислоты.

Мышам F₁ вводят под кожу стоп 3•10⁶ лимфоцитов донора СВА. Клеточную взвесь набирают в шприц и, вколов иглу между первым и вторым пальцами, вводят клетки в пространство под подошвенным аноневрозом по середине стопы. В другую стопу для контроля вводят синченные клетки (от гибридов F₁) в той же концентрации. Через 7 дней мышей забивают и берут от них подколенные лимфатические узлы. Затем их герметизируют в стеклянном гомогенизаторе и определяют число клеток с ядрами (каждый лимфатический узел гомогенизируют в 1 мл среды Хенкса). Поскольку даже синченный ипокулят вызывает определенное увеличение числа таких клеток, в ту или другую стопу всегда вводят одинаковое количество лимфоцитов. Каждая мышь, таким образом, служит для получения как опытных, так и контрольных данных.

Индекс увеличения лимфоузлов (ИУЛ) вычисляют как отношение числа клеток в подколенных узлах опытной и контрольной конечностей.

ИУЛ число клеток после введения полуаллогенной взвеси/число клеток после введения сингенной взвеси
При индексе выше 1,2 отличие от контроля считывается достоверным.

Фагоцитоз филогенетически наиболее древняя форма неспецифической защитной реакции организма, которую открыл И.И.Мечников. Ведущую роль в фагоцитозе играют нейтрофильные гранулоциты и макрофаги. Фагоцитарная активность тканевых макрофагов существенный фактор неспецифической резистентности.

При постановке фагоцитарной реакции учитывают показатели:
1) активность фагоцитоза (фагоцитарный показатель, процент фагоцитоза) - процент фагоцитирующих клеток;
2)интенсивность фагоцитоза среднее число микробов, поглощенное одним фагоцитозом.

Пример осуществления изобретения. Популяцию клеток, богатую макрофагами, получают из перитонеальной полости мышей, которым за 3-е сут до опыта вводят внутрибрюшинно 5 мл 30% стерильного раствора пептона. Брюшную полость мышей, забитых путем дислокации шейных позвонков, промывают в 5 мл охлажденной среды 199, содержащей 5% подогретой (56^oC 30 мин) сыворотки крупного рогатого скота и 5 ед/мл гепарина. Смыв отсасывают из брюшной полости и фильтруют при температуре +4^oC. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева. В среднем от одной мыши получают 5 6•10⁶ клеток перитонеального экссудата. Содержание макрофагов в популяции определяют морфологически при подсчете мазков, окрашенных по Романовскому. Оно обычно составляет около 50 - 60% Жизнеспособность клеток, определяемая по включению трипанового синего, равняется 96 99%
Для получения монослоя макрофагов перитонеального экссудата на покрывном стекле в пенициллиновые флаконы с половинками покровных стекол вносят по 2 мл суспензии перитонеальных макрофагов (1,5-1•10⁶) клеток/см³. Флаконы помещают во влажную камеру с 5% CO₂ в воздухе при 37^oC, через 2 ч среду сливают, удаляя вместе с нею неприлипшие клетки. Во флаконы вносят по 2 мл свежей среды для культивирования, приготовленной на среде 199 с добавлением 15% сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина 100 ед/см³, стрептомицина 100 мкг/см³. Через 24 ч среду сменяют на свежую. Полученный монослой макрофагов исследуют в различных тестах. Содержание макрофагов в монослое на покрывном стекле составляет 96 99%
В нашем эксперименте для оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток, выделенных из перитонеальной полости мышей, исследовали их положительную способность в отношении Staph aurens.

В пенициллиновые флаконы с монослоем макрофагов на покрывных стеклах вносят 1,8 см³ питательной среды и 0,2 см³ взвеси St. aurens (концентрация клеток 2,5•10⁸ клеток/см³).

Флаконы инкубируют во влажной камере с 5% CO₂ в воздухе при 37^oC в течение 40 мин. Среды сливают, покровные стекла с монослоем макрофагов окрашивают по Романовскому.

Учитывали фагоцитарный показатель (ФП) процент фагоцитирующих клеток от общего числа сосчитанных клеток и фагоцитарное число (ФЧ) среднее количество клеток St. aurens, поглощенное одной клеткой.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице. Влияние крапивы коноплевой (экстракта) на показатели иммунной системы мышей (CBAхC₅₇Bl).

Как следует из представленных в таблице данных, экстракт крапивы свежей вызывает стимуляцию антителообразования на введение тимусзависимого антигена. Показатели функциональной активности макрофагов, реакции "трансплантат против хозяина" остаются без изменения.

Таким образом, введение экстракта крапивы коноплевой свежей мышам, подвергнутым воздействию 2,4-Д, восстанавливает показатели антителообразования, стимулирует функцию макрофагов и увеличивает индекс увеличения лимфоузлов в реакции "трансплантат против хозяина".

Установлено, что исследуемые показатели, полученные при введении экстракта крапивы коноплевой, не только достигают уровня показателей контрольных животных, но и превышают их.

В Проблемной лаборатории ВСГПУ разработаны технические условия на новый продукт, обладающий иммунокорригирующими свойствами и применяемый для пищевых целей.

Использование: изобретение относится к области медицинской и пищевой промышленности, а именно к созданию новых продуктов, повышающих защитные функции организма. Сущность: для этого крапиву коноплевую - U.Cannabina применяют в качестве продукта, обладающего иммунокорригирующими свойствами. 1 табл.

Применение крапивы коноплевой U. Cannabina в качестве продукта, обладающего иммунокорригирующими свойствами.