Способ определения антител к гаптенам Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 G01N33/544 

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, в частности, иммунохимического анализа гаптенов и антител против них.

Целью изобретения является упрощение способа определения антител им- муноферментным методом.

Способ осуществляют следующим образом.

Белки-носители в концентрации 0,02 мг/мл в 0,1 М натрий-карбонатном буфере (НКБ) рН 8,0-9,6 заливают по 0,2 мл в лунки иммунологических полистироловых планшетов и инкубируют 4-6 ч при комнатной температуре. Все операции при иммобилизации гаптенов и при проведении в дальнейшем ИФА проводят при комнатной температуре.

После адсорбции белка лунки трижды промывают О,1 М натрий-фосфатным буфером (НФБ) рН 8,0. Ковалентное связывание белков с гаптеном осуществляют инкубацией в лунках в течение 4-6 ч по 0,2 мл раствора гаптена 0,05 мг/мл в 40%-ном растворе этилового спирта в О,1 К НФБ рН 8,0 Лунки трижды промывают 0,1 М натрий-фосфатном буфере+О,1 М NaCl + 0,05% - тритона X 100 (ТФБ) рН 7,4.

На обработанных таким образом планшетах методом ИФА выявляют относительное число молекул гаптена, иммобилизованного на белке-носителе, нанесенного на поверхность твердой фазы по интенсивности окисленного субстрата.

В качестве белка-носителя были испытаны 11 белковых препаратов: казеи- нат натрия, казецит, пепсин, трипсин, бычий, кроличий, молочный и яичный альбумины, желатин, лидальбин и тес- типан.

Из данных ИФА этих препаратов, проведенного с использованием кроличьей антисыворотки против конъюга- та человечий сывороточный альбумин- карбофос (ЧСА-карбофос), антител против кроличьих IgG, меченных перокси- дазой хрена, и 5-аминосалициловой кислоты следует, что лидальбин,

(Я

U 5о оэ соел

чий, кроличий, молочный и яичный альбумины связывают большое число молекул карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата при использовании этих белков была больше двух оптических единиц0 Однако из них только кроличий и яичный альбумины не дают перекрестных реакций с кроличьей антисывороткой против конъюгата ЧСА- карбофос.

Антисыворотку, полученную иммунизацией кроликов конъюгатом ЧСА-гапте в разведениях 1:100, 1:200, 1:400; 1:800; 1:1600; 1:3200, заливают в лунки планшетов с иммобилизованным гаптеном по 0,2 мл и инкубируют 1 ч. После инкубации лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий иммуноглобулин, меченный пероксида- зой хрена (коммерческий препарат) в разведении 1:200, и инкубируют 1 ч, Затем лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4, заливают субстратом по 0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки, чтобы объем одной пробы был 2 мл. и спектрофотомет- рируют при 450 нм на спектрофотометре СФ-26.

Пример 1.0,4мг лидальби- на растворяют в 20 мл 0,1 М НКБ рН 9,0 заливают по 0,2 мл в лунки иммунлогических полистироловых планшетов и инкубируют 4 ч. Лунки пронывают 0,1 М НФБ рН 9,0, затем заливают по 0,2 мл раствора ангидрида карбофоса 0,05 мг/мл в 40%-ном растворе этилового спирта в 0,1 М НФБ рН 8,0 и выдерживают 6 ч Лунки трижды промываю 0,1 М ТФБ рН 7,4о Обработанные таким образом иммунологические планшеты используют в дальнейшем для проведения ИФА,

Антисыворотку, полученную иммунизцией кроликов конъюгатом ЧСА-карбо- фос, в разведении 1:200 заливают в лунки планшетов с иммобилизованным гаптеном по 0,2 мл и инкубируют 1 ч После инкубации лунки трижды промы

вают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий 5Q ленного субстрата составляла 0,08- иммуноглобулин, меченный пероксида- 0,09 оптических единиц.. зон хрена в разведении 1:200, и инкубируют 1 ч. Затем лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4, заливают субстратом по 0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки, чтобы объем одной пробы был 2 мл, и спект55

Таким образом, яичный альбумин н дает перекрестных реакций с антисыв роткой, связывает большое количеств молекул карбофоса и его можно испол зовать в качестве белка-носителя дл иммобилизации гаптена и для дальней шего проведения ИФА антител против

рофотометрируют при 450 нм на спектрофотометре СФ-26.

$

Приготовление субстрата:

A)30 мг 5-миносалициловой кислоты растворяют в 50 мл кипящей воды, охлаждают и доводят рН до 5,6-5,8;

Б) 0,2 мл 30%-ной перекиси водорода + 1,8 мл

B)из раствора Б готовят рабочий раствор перекиси водорода: 0,1 мл раствора Б + 3,3 мл HijO.

Из раствора В отбирают 1 мл и добавляют к нему 10 мл раствора А и получают раствор субстрата.

Наличие в испытуемых белках антигенных детерминантов, общих с используемым для получения противогаптенных антисывороток человечьим сывороточным альбумином, оценивалось также методом ИФА по интенсивно ти окраски 0 окисленного субстрата в лунках планшета с адсорбированным белком и не обработанным ангидридом карбофоса.

Данные ИФА показывают, что лидаль- бин связывает большое число молекул 5 карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата составляет 2,34 оптических единиц. Однако лидальбин дает перекрестную реакцию с антисывороткой против ЧСА-карбофос, оптическая плотность окисленного субстрата 2,14 оптических единице

Таким образом, лидальбин можно использовать в качестве белка-носителя для иммобилизации гаптена, но применять в дальнейшем для ИФА не рекомендуется „

Пример 2.В качестве белка- носителя используют яичный альбумин. Все приемы и операции проводят в той же последовательности, как в примере 1.

Из данных иммуноферментного анализа следует, что яичный альбумин связывает большое число молекул кар- 5 бофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата равна 1,2-1,4 оптических единиц. При определении перекрест ной реакции яичного альбумина с анти сывороткой оптическая плотность окис0

5

0

ленного субстрата составляла 0,08- 0,09 оптических единиц..

Таким образом, яичный альбумин не дает перекрестных реакций с антисывороткой, связывает большое количество молекул карбофоса и его можно использовать в качестве белка-носителя для иммобилизации гаптена и для дальней-, шего проведения ИФА антител против

гаптенов, в частности, против карбофоса.

Антисыворотку, полученную иммуниг зацией кроликов конъюгатом ЧСА-кар- бофос в разведениях 1:100, 1:200; J:400, 1:800; 1:1600; J:3200, заливают в лунки планштетов с иммобилизованным карбофосом по 0,2 мл и инкубируют 1 ч. После инкубации лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий Ig, меченный пероксида- зой в разведении 1:200, и инкубируют 1 ч. Затем лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4, заливают субстратом по 0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки объемом не менее 2 мл и спектрофотометрируют при 450 им.

Антитела к карбофосу обнаружены в разведениях сыворотки 1:800.

Пример 3. В качестве белка- носителя используют кроличий альбумин. Все приемы и операции проводят в той же последовательности, как в примере 2.

Из данных иммуноферментного анализа следует, что кроличий альбумин не дает перекрестных реакций с антисывороткой, связывает большое число молекул карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата составляет 2,56 оптических единиц. Таким образом, кроличий альбумин можно исПредлагаемый способ по сравнению с прототипом расширяет круг лабораторий, использующих методы иммуноферментного анализа в своей практической деятельности,, .В , качестве носителя в иммунохимических методах анализа могут быть использованы, белки, не образующие растворимые конъюгаты

0 с гаптеном, а также белки, которые при исчерпывающей иммобилизации на них гаптена, выпадают в осадок. Значительно снижается трудоемкость выявления белков-носителей для иммуно5 химического метода, так как отпадает необходимость в отработке условий синтеза конъюгата для каждого испытуемого белка и анализируемого гаптена. Анализ 11 белковых препаратов на

0 пригодность в качестве белка-носи- теля в ИФА занимает 11-12 ч. Упрощается способ определения антител против гаптенов методом ИФА, Формула изобретения

5 Способ определения антител к гап- тенам, включающий конъюгацию гаптена с белком-носителем, адсорбцию конъюгата на поверхности твердой фазы, соединение с исследуемыми антителами

0 и выявление присоединившихся антител методом иммуноферментного анализа (ИФА), отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве белка-носителя используют .кро

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения является упрощение способа определения антител иммуноферментным методом. Цель достигается тем, что при конъюгации гаптена с белком-носителем в качестве последнего используют кроличий или яичный альбумин, который адсорбируют на поверхности твердой фазы.

пользовать в качестве белка-носителя 35 личий яичный альбумин, при этом для определения антител против ran- его адсорбируют на поверхность твер- тенов в ИФА.дои фазы и конъюгируют с гаптеном.