N,N-ДИБЕНЗИЛГЛИЦИН И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОНИКАТЬ ЧЕРЕЗ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР Российский патент 1997 года по МПК A61K31/19 

Изобретение относится к области органической химии к ряду производных аминоуксусной кислоты (глицина), а именно к N,N- дибензилглицинтрис-(2-гидрокси-этил) аммониевой соли (последняя является ранее неизвестным соединением) общей формулы (C₆H₅CH₂)₂NCH₂COOR, R=H (I) HN(CH₂CH₂)₃ (II), обладающими способностью проникать через гематоэнцефалический барьер, противосудорожным действием и проявляющими защитный эффект при токсическом стрессе, которые могут найти применение при изготовлении лекарственных препаратов для профилактики и лечения стрессорных повреждений организма.

Ближайшим структурным аналогом к заявляемым соединениям является глицин, одна из наиболее важных центральных тормозных аминокислот, играющая, по-видимому, роль медиатора одной из естественных стресслимитирующих систем [1] Несмотря на биологические свойства эндогенного глицина, применение экзогенного не позволяет получать необходимый эффект, так как он не проникает через гематоэнцефалический барьер [2]
Так в результате неспособности пройти ГЭБ при моделировании стрихниновых судорог предварительное введение даже больших доз глицина не оказывает защитного эффекта, несмотря на то, что глицин является мощным конкурентом стрихнина за специфические рецепторы (Раевский К.С. Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты: нейрофармакологические и нейрохирургические аспекты. М. Медицина, София: Медицина и физкультура. 1986, с.239).

При токсическом стрессе, по нашим данным, глицин оказывает значительный защитный эффект при использовании его только в большой концентрации (200 мг/кг внутрибрюшинно до затравки толуолом и плюс 2 дня при воздействии толуола), так как экзогенный глицин при обычном введении не проходит ГЭБ. Однако, как известно, введение больших доз лекарственных препаратов затрудняет их вывод из организма и может оказывать побочные эффекты. Поэтому весьма актуальным является создание новых химических аналогов глицина, которые способны проходить через ГЭБ.

Предлагаемые нами соединения способны оказывать такой же защитный эффект при токсическом стрессе как и глицин, но в значительно меньшей дозе (50 мг/кг), благодаря своей способности проникать через ГЭБ. Кроме того заявляемые вещества могут быть получены из дешевого легко доступного отечественного сырья.

Целью предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств, обладающих способностью проходить гематоэнцефалический барьер, оказывающих противосудорожное действие и защитный эффект при токсическом стрессе.

Поставленная цель достигается использованием N,N-дибензилглицина и его трис-(2-гидроксиэтил) аммониевой солью, проникающих через ГЭБ, обладающих противосудорожным эффектом и защитным действием при токсическом стрессе.

Пример 1. Получение N,N-дибензилглицина (I). В 50 мл этилового спирта последовательно растворяли 19,7 г (0,1 моля) дибензиламина и 11,6 г (0,1 моля) хлорацетата натрия. После разогрева реакционной смеси до кипения в течение 15 мин наблюдалась автотермическая реакция. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 3 ч и обрабатывали раствором 2 мл концентрированной HCl в 50 мл ацетона и 50 мл эфира, сушили в вакууме. Выход 19 г (74,5%), т. пл. 200^oC (Belstein). Полученное соединение 1 представляет собой бесцветные кристаллы, плохорастворимые в воде и органических растворителях.

Пример 2. Получение трис-(2-гидроклиэтил) аммониевой соли N,N-дибензилглицина (II).

В 15 мл кипящего этилового спирта растворяли 3,14 г (0,013 моля) N,N-дибензилглицина (II) и 1,94 г (0,013 моля) триэтаноламина. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре в контакте с воздухом для медленного испарения спирта. Через 48 ч объем раствора сократился до 9,5 мл. Фильтрованием отделяли выпавшие кристаллы триэтаноламмониевой соли N,N-дибензилглицина (II). Выход 1,5 г (29,5%) после промывки ацетоном и сушки в вакууме 1 мм рт. ст. в течение 2 ч, т.пл. 173^oC. Элементный состав, найдено, C 65,28; H 7,73; N 6,57.

C₂₂H₃₂N₂O₅.

Вычислено, C 65,34; H 7,92; N 6,93. Полученное соединение II белые кристаллы слабо- растворимые в воде и органических растворителях.

Пример 3. Испытание противосудорожной активности N,N-дибензилглицина и трис-(2 гидроксиэтил) аммониевой соли N,N-дибензилглицина и их способности проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В настоящее время придается большое значение исследованию широкого спектра физиологической активности медиаторных аминокислот и их структурных аналогов /Ковалев Т.В. Аналоги медиаторных аминокислот новый класс психотропных и сердечно-сосудистых средств. Труды межреспубликанской научно-практической конференции "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных и сердечно-сосудистых веществ". Волгоград, 1989, с. 125./ Создание новых лекарственных средств на основе медиаторных аминокислот является перспективным направлением, позволяющим пополнить арсенал приоритетных психотропных и сердечно-сосудистых препаратов.

Особый интерес представляет изучение производных глицина, являющихся одной из наиболее важных центральных тормозных аминокислот и играющего, по-видимому, роль медиатора одной из естественных стресслимитирующих систем. Его физиологические эффекты реализуются через специфические глицинергические рецепторы, а антагонистом глицина является стрихнин, которые блокируют многие эффекты глицина /Раевская К.С. Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты нейрофармакологические и нейрохимические аспекты. 1986, М. Медицина, София: Медицина и физкультура, с. 239/. Следует подчеркнуть, что, несмотря на биологические свойства эндогенного глицина, применение экзогенного не позволяет получить необходимый эффект, так как он не проникает через гемато-энцефалический барьер. Поэтому весьма актуальным является создание новых химических аналогов глицина, которые способны проходить через ГЭБ. При скрининге таких соединений наиболее адекватной является модель стрихниновых судорог.

Нами изучено влияние N,N-дибензилглицина, его соли (II) и чистого глицина на развитие стрихниновых судорог. Опыты проводились на 72 половозрелых самцах белых лабораторных беспородных крыс массой 150-180 г.

Наркотизированным этаминалом натрия животным (12 крыс) с контрольной группе вводили стрихнин в дозе 1,5 мг/кг внутрибрюшно (в/б). Через 2,7±1,2 мин развивались стойкие спонтанные судороги и в течение 12,1 ± 1,8 мин животные погибали.

В первой подопытной группе (18 крыс) за 30 мин до инъекции указанной дозы стрихнина внутривенно (в/в) вводили чистый глицин в дозах 100, 50, 25 мг/кг на физиологическом растворе. Развитие судорог и летальный исход отмечены за те же временные сроки, что и в контрольной группе.

Во второй подопытной группе (18 крыс) за 30 мин до инъекции стрихнина в/в вводили N,N-дибензилглицин в дозах 100, 50, 25 мг/кг в виде суспензии с "твин-80" на 0,85% NaCl (предварительно было установлено, что in vitro соединение не изменяет коагуляционную активность плазмы крови).

В третьей подопытной группе (14 животных) за 30 мин до инъекции стрихнина вводили в/в трис-(1 гидроклиэтил) аммониевую соль N,N-дибензилглицина в дозах 50 и 25 мг/кг веса в виде суспензии в "твин 80" на 0,85% растворе NaCl.

Статистическая обработка данных проведена общепринятым методом (Манцевичуте-Эригене Е. В. Упрощенные математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе //Патологическая физиология и экспериментальная терапия 1964, N 7, с. 71-74).

Как видно из табл. 1, при в/в введении N,N-дибензилглицина в дозе 100 мг/кг удлиняется время жизни после инъекции стрихнина в 5,1 раза в дозе 50 мг/кг в 4,4 раза, в дозе 25 мг/кг в 2 раза по сравнению с контролем. При в/в введении трис-(2 гидроксиэтил) аммониевой соли N,N-дибензилглицина в дозе 50 мг/кг время жизни животных после введения стрихнина увеличивается в 4 раза, а в дозе 25 мг/кг в 2,3 раза по сравнению с контролем. Спонтанные судороги у этих крыс начинались позднее и были менее четко выражены, чем у контрольных животных.

Полученные результаты свидетельствуют, что если чистый глицин не проникает через гематоэнцефалический барьер, то его синтетические структурные аналоги N, N-дибензилглицин и его соль обладают такими свойствами. Острая токсичность соединений I и II определялась по методу Кербера на самцах и самках белых беспородных лабораторных мышей LD₅₀ > 1300 мг/кг.

Таким образом нами выявлены нетоксичные производные медиаторной аминокислоты глицина N,N-дибензилглицина и его трис-(2 гидроксиэтил) аммониевая соль, быстро проникающие через ГЭБ и проявляющие противосудорожный эффект при стрихниновых судорогах.

Пример 4. Испытание защитного действия при токсическом стрессе. Опыты проведены на 32 беспородных крысах-самцах, из которых 9 составили контрольную группу, 7 подвергались воздействию толуола (ВТ) и 16 животных (по 8 в каждой группе), предварительно перед ВТ вводили дибензилглицин (50 мг/кг в/б и глицин /200 мг/кг, в/б). Срок ВТ на уровне 10 мг/л ограничивался 2 днями. Дибензилглицин вводили двукратно за 10 мин до ВТ. Глицин использовался по схеме: 8 дней до затравки и плюс 2 дня при ВТ.

В качестве показателей гемостаза в сыворотке крови животных определялись следующие продукты перикисного окисления липидов (ПОЛ): содержание диеновых коньюгатов (ДК) (Гаврилов В.Н. и др. Лаб. дело, 1983, N 3, с. 33-36), уровень малонового диальдегида (МДА) (Smith S.B. Ingerman P.M. Silver M.J. Malondialdehyde formation production bu human p.Catelets// Jorn.Lab.Clin.med. 1976, Vol. 88, p. 167-172), активность аспарагиновой (АСТ) и аланиновой (АЛТ) трансаминаз, антиокислительную активность (АОА) и содержание глюкозы (Г) определяли на анализаторе FF-901 фирмы "Labsystems", Финляндия. Стандартными методами исследования проведены на базе биохимического отдела ЦНИЛ Иркутского мединститута.

В результате острого ВТ получены данные (табл. 2), которые показывают, что толуол (Т) существенным образом изменяет параметры гемостаза, характеризующие функционирование монооксигеназных систем гладкого эндоплазматического ретикулума и сопряженные с ним реакции коньюгации.

На основании литературных данных (Каган В.Е. Шведова А.А. Новиков К.И. "Об участии фосфолипазы в восстановлении фоторецепторных мембран, подвергнутых перекисному окислению", Биофизика, 1978, т.23, с. 279-284) можно предположить, что в основе активации ПОЛ при ВТ лежат механизмы лабилизации системы лизосом, из которых освобождаются фосфолипазы, разрушающий бислой мембран клеток с образованием лизофосфатидов, которые совместно со свободными жирными кислотами нарушают упорядоченное расположение фосфолипидов в мембранах, вызывая увеличение проницаемости мембран для Ca²⁺, и последний вновь активирует фосфолипазы и пол, т.е. замыкается порочный круг, ведущий к чрезмерной активности ПОЛ. Данный процесс сопровождается увеличением активности АСТ, АЛТ и содержания в периферической крови глюкозы.

С целью уменьшения повреждающих эффектов активации ПОЛ при ВТ использованы дибензилглицин и глицин. Результаты опытов показывают, что при предварительном применении названных препаратов на фоне острого ВТ все показатели ПОЛ снизились, увеличилась АОА, но практически не изменилась активность трансаминаз и содержание глюкозы по сравнению с данными, полученными на ВТ (табл.2).

Каковы же механизмы положительного эффекта примененных нами препаратов в снижении показателей ПОЛ? Детоксическое действие аминокислоты глицина объясняется участием ее во второй фазе биотрансформации Т, так как способностью глицина коньюгировать метаболит Т бензойную кислоту с образованием нетоксичных гиппуровой и метилгиппуровой кислот. Точка же приложения дибензилглицина в ингибировании макрососальных монооксигеназ неизвестна. Участие дибензилглицина в механизмах детоксикации Т построена на рабочей гипотезе о включении его в реакцию глициновой коньюгации и концепции Ф.З. Меерсона ("Адаптация, стресс и профилактика". М. Наука, 1981) о роли тормозных медиаторов и пептидов ЦНС в механизме ограничения стресс-реакций и участие их в формировании адаптации организма к повторным стрессовым воздействиям.

Мы предполагаем, что механизм положительного действия дибензилглицина в применяемой дозировке опосредован прежде всего включением его в реакцию глициновой коньюгации, так как его эффект практически не отличался от глицина в наших опытах, но не исключает и участие глицинергической тормозной системы, широко представленной в ЦНС. Вполне возможно, что здесь имеет место синергизм периферических и центральных механизмов поддержания гомеостаза при ВТ.

Таким образом, нами выявлен высокий защитный эффект нового вещества - N, N-дибензилглицина при токсическом воздействии толуола. Данное производное медиаторной аминокислоты глицина проявляет протекторное действие в меньшей дозе (50 мг/кг), чем глицин (200 мг/кг). Этот факт объясняется его способностью проходить через гематоэнцефалический барьер.

Изобретение относится к медицине. Сущность изобретения заключается в том, что получены вещества формулы (C₆H₅-CH₂)₂NCH₂COOR, где R= H или HN(CH₂-CH₂)₃. Эти соединения обладают способностью проникать через гематоэнцефалический барьер, противосудорожным действием и проявляют защитный эффект при токсическом стрессе. 2 табл.

N₁N-дибензилглицин и его трис-12-гидроксиэтиламмониевая соль общей формулы (C₆H₅CH₂)₂NCH₂, COOR, где R H или HN (CH₂,CH₂)₃, обладающие способностью проникать через гематоэнцефалический барьер, противосудорожным действием и проявляющие защитный эффект при токсическом стрессе.