СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/70 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения из мицелия грибов препаратов, обладающих ранозаживляющим действием.

Известно, что в качестве лечебных средств при лечении ожоговых травм используют поливиниловый спирт, полиоксипропилен, коллаген, ферментсодержащие средства и природные стимуляторы типа облепихового масла, подсолнечного масла и др. Имеются также данные о применении для этих же целей полиаминосахаридов (хитина, хитозана), их мономеров и производных, а также композиций, состоящих из солей органических кислот и хитина.

Лечебно-заживляющий эффект производных хитина предложено даже использовать для лечения волос, причем не только при ранениях, но и как репарирующее средство, применяемое в специальных пастах, содержащих, например, хитозан с 90 свободных аминогрупп.

Для составления противоожоговых композиций используют обычно производные хитина, полученные из крабов или омаров. Так, в последние годы противоожоговые повязки на основе хитина крабов выпускает Япония (название повязки Beschitin W). Коммерцией этого хитинового изделия занимается японская фирма Unitika. Однако в настоящее время более доступным и дешевым сырьем является хитит и его производные, получаемые из клеточных стенок грибов. Это объясняется сокращением популяции ракообразных (Crustaceae) из-за загрязнения окружающей среды, нарушением природных пищевых цепочек в результате массового отлова рыб и ракообразных и уничтожением водорослей и зоопланктона. Кроме того, высокая стоимость и дефицитность крабов связаны также с сезонностью их отлова.

Указанных выше недостатков, свойственных этой сырьевой базе, лишены мицелиальные грибы, получаемые биотехнологическим способом в ферментах. Такой способ получения сырья не зависит от сезонности, процесс занимает всего 3-4 дня, может быть использовано дешевое сырье для получения питательных сред, например, мука, древесные отходы. Очень существенно, что полученные при этом полиаминосахариды не содержат тяжелые металлы, производные фенола, т.е. те примеси, которые обнаруживаются в хитине ракообразных и делают непригодными получаемые на базе этих полиаминосахаридов лечебные препараты.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ использования хитина для заживления ран, согласно которому грибы (Mucor spinosus, Aspergillus niger, Penicillium, Cryptococcus) выращиваются на твердых средах поверхностным способом. В состав сред выращивания входят: бычье сердце (или коровье), мозги теленка, пептон, сахароза, бактопептон и др. Выращенный мицелий грибов вместе с субстратом стерилизуют кипячением, далее отделяют грибную биомассу, отмывают ее и высушивают, затем удаляют хлороформом жирорастворимый материал при комнатной температуре. Обезжиренный материал обрабатывают далее 1 н щелочью в течение 18 ч и подкисляют соляной кислотой, отмывают водой и диализируют против дистиллированной воды. Описанные процедуры по очистке мицелия повторяют, далее материал сушат в вакууме при температуре не выше 50 ^oC и получают серую, рыхлую массу. При испытаниях на животных этот продукт увеличивал на 20 заживление ран по сравнению с контрольными животными.

Недостатком данного способа является использование: дорогостоящих и дефицитных сред, поверхностного способа выращивания, что ограничивает масштабы производства, применение хлороформа, который является дорогостоящим и канцерогенным растворителем, запрещенным к применению во всех биотехнологических производствах. Кроме того, в качестве грибов предлагается использовать аскомицетные грибы, например, аспергиллы, которые содержат афлатоксины, а при поверхностном способе выращивания, так же как и Penicillium, образуют споры, распространяющиеся воздушным путем и вызывающие аллергенные и легочные заболевания.

Целью данного изобретения является разработка нового способа получения из мицелия грибов хитинсодержащих препаратов, оказывающих заживляющее действие на раны, полученные в результате ожоговых травм, а также расширение числа используемых продуцентов.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что мицелиальные грибы, относящиеся к порядкам Phycomycetes и Basidiomycetes (Cunninghamella japonica BRMF-1204(-), Pleurotus ostreatus BRMF721, Blakeslea trispora A-732-3(+) и A-732-3(-) выращивают в погруженной культуре. Выращенную биомассу отделяют от среды культивирования и прогревают на водяной бане при температуре 98 ^oC в течение ч. Отфильтрованную биомассу гомогенезируют и обрабатывают 1 н щелочью с добавлением детергента в течение 12 ч при интенсивном перемешивании при температуре 28 ^oC. Следующая стадия очистки включает повторную гомогенизацию целевого продукта и его обработку 1 этанолом в 0,3 н щелочи при температуре 96 ^oC в течение 1 ч. Далее целевой продукт диализируют в течение 12 ч против дистиллированной воды с последующей лиофильной сушкой.

Кипячение с водой способствует удалению водорастворимых, несвязанных ковалентно или ионными связями соединений: белков, углеводов, органических кислот и др. Обработка 1 н щелочью с детергентом дает возможность удалить часть прочносвязанных щелочерастворимых белков, липидов и углеводов. Разрыву межмолекулярных связей в биополимерах значительно способствует введение детергента. Обработка щелочью с этанолом приводит к дальнейшему удалению цитоплазматического содержимого мицелия грибов, включая белки, углеводы и особенно жирорастворимые соединения.

Полученный таким способом препарат, названный "Микораном", представляет собой порошок бежевого цвета. Этот препарат испытывали на крысах-самцах весом 200-220 г на экспериментальных моделях ожога кожи (термические ожоги) в сравнении с активностью заживления ран у контрольных животных. Лечение препаратами из мицелиальных грибов начинали сразу после нанесения ожога, площадь которого составляла 30-40 от поверхности тела, т.е. наносили 250 мг препарата на см² раны. Проводились гистологические, микробиологические и цитологические исследования ожоговых ран, на которые наносили препараты. В качестве второго контроля использовали также животных, которых лечили препаратом "Гелевин", широко используемым в настоящее время как противоожоговое средство.

Пример 1. Мицелиальный гриб Cunninghamella japonica BKMF-1204(-) выращивают на среде следующего состава: соевая мука 4 кукурузная мука - 1,73 KH₂PO₄ 0,05 pH среды 5,8, стерилизация ведется при 1 атмосфере 30 мин. Полученную биомассу отделяют от среды выращивания и в количестве 20 г (влажность биомассы 70-80) подвергают гомогенизации 3 раза в течение 3 мин для удаления цитоплазматического содержимого. Далее гомогенизированную биомассу, содержащую фрагменты мицелия, помещают в колбу, добавляют 4-х кратный объем воды и прогревают 1 ч при 98 ^oC, не допуская кипения. Биомассу отфильтровывают, делят на 4 равные части и помещают в колбы на 2,5 л, куда добавляют 0,5 л 0,2 раствора детергента в 1 н растворе NaOH. В качестве детергента используют стиральный порошок "Лотос". Колбы с биомассой выдерживают при интенсивном перемешивании в течение 12 ч при температуре 28 ^oC. Далее для нейтрализации добавляют 0,5 л 1 н HCl. Осадок отмывают горячей водой (с температурой 98 ^oC), затем холодной водой до pH 7,0. Осуществляют микроскопический контроль за удалением цитоплазматического содержимого мицелия. Следующая стадия обработки включает повторную гомогенизацию целевого продукта, его обработку 1 этанолом в 0,3 н щелочи при температуре 96 ^oC в течение 1 ч при интенсивном перемешивании. Затем осадок нейтрализуют 0,3 н соляной кислотой и отмывают горячей и холодной водой до нейтральной реакции. На этой стадии обработки микроскопический контроль должен показать значительную потерю цитоплазматического содержимого гиф и преобладание фракции клеточных стенок, в противном случае щелочные обработки необходимо повторить. Последующий этап обработки проведение диализа против дистиллированной воды (целевой продукт помещают в целлофановый мешочек) в течение 12 ч для удаления (целевой продукт помещают в целлофановый мешочек) в течение 12 ч для удаления солей тяжелых металлов и соединений с низким молекулярным весом. Далее продукт сушат лиофильно и подвергают размельчению до стадии мелкодисперсного порошка. Выход целевого продукта составляет до 20 от веса исходной сухой биомассы. При испытании на животных, по данным цитологических и гистологических исследований, препарат оказывает лечебный эффект: гнойное воспаление и некроз тканей носят поверхностный характер, идет почти полное созревание грануляций, а также образование молодой и даже зрелой соединительной ткани, обнаружены регенераторные явления со стороны мышечной и жировой ткани.

Пример 2. То же, что пример 1, но в качестве мицелиального гриба используют штамм Pleurotus ostreatus BRMF-721. Гриб выращивают на среде того же состава, что и в примере 1, но с добавлением 1 растительного масла, pH среды 6,9, ферметация продолжается пять суток. Выход целевого продукта 15 Результаты испытаний на животных аналогичны данным, приведенным в примере 1.

Пример 3. То же, что пример 1, но в качестве мицелиального гриба используют Blakeslea trispora A-732-3 (+) и A-732-3 (-), полученные из промышленной коллекции A/O "Уралбиофарм" (бывший завод "Медпрепаратов", г. Екатеринбург). В этом случае препарат, названный "Микораном", при испытаниях на животных показал ярковыраженный стимулирующий эффект, превосходящий таковой в примерах 1 и 2, а также в препарате "Гелевин", на процессы регенерации тканей при ожоговых травмах. Препарат "Микоран" обеспечивает эпителизацию ожоговой раны статически достоверно быстрее, чем при лечении ожоговой раны "Гелевином" и по сравнению с контрольными животными. Кроме того, применение препарата "Микоран" обеспечивает уменьшение обсемененности ран инфицирующими микроорганизмами на всех сроках наблюдения. Результаты испытаний суммированы в таблице 1. Испытания проводились в Ожоговом Центре Института хирургии им. Вишневского РАМН. Отчет прилагается.

Пример 4. То же, что и пример 3, но биомассу B. trispora выращивали на среде с добавлением 5 подсолнечного масла. Полученный описанным выше способом препарат содержал на 30-40 больше липидов, чем препарат "Микоран". Лечение этим препаратом оказывает положительный эффект на заживление ран при ранних стадиях лечения: отмечается наименьшая обсемененность ран и отсутствие гнойного воспаления на дне раны. В дальнейшем заживляющее действие выражено слабее, чем у "Микорана".

Пример 5. То же, что пример 3, но обработку препарата 0,3 н щелочью со спиртом повторяют два раза. Полученный таким путем препарат содержит на 30-40 меньше липидов, чем препарат "Микоран". Медико-биологические испытания показали, что заживляющая способность сохраняется, и препарат обеспечивает быструю эпителизацию ожоговой раны и оказывает ярко выраженный эффект на процессы регенерации, однако несколько более слабый, чем у препарата "Микоран".

Предлагаемый способ позволяет значительно упростить, обезопасить и удешевить технологию получения противоожоговых препаратов за счет более дешевой и доступной среды выращивания грибов-продуцентов, удаления дорогостоящего и канцерогенного растворителя-хлороформа, а также расширить число продуцентов. Кроме того, выращивание грибов-продуцентов в глубинной культуре позволяет масштабировать процесс и обезопасить его. Это достигается тем, что при выращивании биомассы гриба отсутствует стадия спороношения, вызывающая у обслуживающего биотехнологический процесс персонала аллергические и легочные заболевания. По сравнению с аналогом "Микоран" исследован с медико-биологических позиций значительно подробнее (проведены цитологические, гистологические и бактериологические исследования), что позволяет говорить о высоком ранозаживляющем эффекте препарата.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для получения из мицелиальных грибов ранозаживляющих препаратов. С этой целью выращенный мицелий гомогенезируют, обрабатывают горячей водой и щелочью с детергентом. После повторной гомогенизации биомассу прогревают со спиртовой щелочью и далее диализируют против воды и лиофильно высушивают. 1 табл.

Способ получения ранозаживляющего препарата, включающий выращивание мицелиального гриба-продуцента на питательной среде, отделение биомассы и получение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют культуру Cunningamella japonica ВКМF-1203(-), или Plurotus ostreatus ВКМF-721, или Blekeslea trispora А-732-3(+) и (-), а выращивание осуществляют на жидкой питательной среде, содержащей 4% соевой муки, 1,75% кукурузной муки, 0,05% КН₂РО₄, 94,5% воды, отделенную биомассу гомогенизируют, прогревают в колбах с водой при 96^oС в течение 1 ч, после чего в нее вносят 0,2% -ный раствор детергента в 1 н. растворе щелочи и выдерживают в течение 12 ч при 28^oС при интенсивном перемешивании, проводят повторную гомогенизацию и целевой продукт получают путем обработки гомогената 1%-ным раствором спирта в растворе 0,3 н. щелочи с последующим прогревом при 95^o в течение 1 ч и дальнейшей диализацией в течение 12 ч против дистиллированной воды с последующей лиофильной сушкой.