СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНГЛЮКАНОВОГО КОМПЛЕКСА Российский патент 1998 года по МПК C12P19/04 C08B37/02 C12N1/14 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения из мицелиальных грибов полисахаридов, в том числе полиаминосахаридов - хитина и хитозана.

Известно, что основная часть биотехнологической продукции приходится на долю промышленной микробиологии, где с помощью мицелиальных грибов получают почти 80% биологически активных соединений (БАС), в том числе антибиотики, витамины, органические кислоты, ферменты. В последнее время в биотехнологии наблюдается четкая тенденция увеличения объема и расширения ассортимента продуктов, получаемых с использованием мицелиальных грибов. В связи с этим особое значение приобретают вопросы утилизации отходов этих производств и в первую очередь грибного мицелия. Остающаяся грибная биомасса при хранении в отвалах становится опасной для здоровья людей, так как делается источником загрязнения окружающей местности канцерогенами, иммунносупрессорами и особенно аллергенами. В то же время известно, что в клеточной стенке (КС) грибов содержится значительное количество хитина и других полисахаридов, что делает отходы от грибных производств привлекательным сырьем для получения ценных БАС. Следует указать, что основной биополимер КС грибов - хитин и особенно его производное хитозан начинают широко использоваться в медицине, сельском хозяйстве, косметике и промышленности. Особенно велико значение полиаминосахаридов в медицине, где они используются как основа для создания ранозаживляющих повязок, входят в состав лекарств от пародонтоза и служат основным полимером для мембран искусственных почек.

Однако в отличие от хорошо исследованных и широкоиспользуемых способов получения хитина и хитозана из панцирей ракообразных технология выделения этих полиаминосахаридов из КС мицелиальных грибов нуждается в существенных доработках. Эта задача осложняется еще и тем, что химический состав КС грибов не одинаков и зависит от природы грибного мицелия, его возраста и условий выращивания.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения хитинсодержащего комплекса из мицелия Aspergillus niger, с помощью которого получают лимонную кислоту. Отметим, что ввиду особенности химического состава КС этого гриба технологически более выгодно не выделять индивидуальный хитин, а получать комплекс хитина с другим полисахаридом KC-β-(1→3) глюканом (хитинглюкановый или хитозанглюкановый комплекс - ХГК). По своим физико-химическим свойствам β-(1→3) глюкан близок хитину, в частности является также щелоченерастворимым, что затрудняет его отделение от хитина. В то же время наличие в комплексе глюкана позволяет использовать ХГК в более широком направлении, например в качестве флокулянта, для получения более активных сорбентов, в качестве элиситорных соединений в сельском хозяйстве /4,6/.

ХГК был впервые получен в 1979 г. /3/. более поздние патенты относятся к 1981 г. /2/ и 1083 г. /1/. В открытой печати способ получения комплекса хитина и глюкана из A.niger был опубликован в 1980 г. /5/, где подробно описывались его хелатирующие, коагулирующие и пленкообразующие свойства. Сущность описанного в этих патентах способа состояла в обработке мицелия A.niger и других грибов щелочью, имеющей концентрацию 2,5% и 40%. Описан способ получения ХГК из A.niger и Fusarium moniliforme, отличающийся тем, что для обработки мицелия используют только концентрированную щелочь /6/.

Наиболее близким по технической сущности к предполагаемому изобретению является способ получения хитозанглюканового комплекса из мицелиальных грибов, в частности из A.niger /1/. Согласно этому способу биомасса A.niger (черного цвета) после получения на заводе лимонной кислоты в количестве 1 кг подвергается отмывке в течение 30 минут 2,5% NaOH (1:10). Выход биомассы после отмывки составляет 50%, так как часть белков, липидов, пигментов и часть растворимых полисахаридов извлекается из мицелия во время этой обработки. Далее продукт (500 г) подвергают воздействию 40% NaOH (1:2,5) в течение 6 часов при t=128^oC для удаления оставшихся биополимеров и проведения деацетилирования. Получают белый конечный продукт (ХГК), содержащий 32% хитозана. Выход ХГК от лиофильно высушенной биомассы составляет 55%.

В указанном выше способе получения ХГК из отходов биомассы A.niger мицелий получают на среде, не содержащей мелассы (отход от свекловичных производств при получении сахара). Однако современные заводы по производству лимонной кислоты используют среду, содержащую этот отход как дешевый и легкодоступный источник углерода. В процессе подготовки среды для ферментации мелассу подвергают соответствующим обработкам, обработки проводят и в конце ферментации, в частности, с этой целью используют K₃Fe(CN)₆. Все это приводит к значительному загрязнению отработанного мицелия металлами и органическими веществами, присутствующими в виде комплексов с металлами. Поэтому указанный выше способ получения ХГК /1/ может быть использован только в ограниченных случаях. Кроме того, в способе, описанном в прототипе, используют для получения ХГК более концентрированную (40%) щелочь, что приводит к накоплению агрессивных стоков, представляющих опасность для заводских коммуникаций и может привести к экологическим нарушениям. Наконец, время получения ХГК составляет около 7 часов, а учитывая отмывки щелочной биомассы, длительность процесса получения увеличивается до 10-12 часов.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка нового способа получения ХГК из мицелия A.niger. Способ должен быть более широко используемым, т. к. должен учитывать специфические особенности выращивания мицелия в условиях заводов. Кроме того, предлагаемый способ должен быть экологически более чистым, не требовать концентрированных кислот и щелочей, и процесс должен занимать меньшее количество времени, чем в прототипе.

Как указывалось выше, в прототипе A.niger выращивают в условиях завода, не используя мелассу. Применение этого дешевого отхода в большинстве других технологий способствует, однако, значительному увеличению зольности биомассы, которая в условиях заводов, например АО "Цитробел" (Белгород), может достигать 12-15% и выше. Как показал рентгено-структурный анализ, основным элементом, загрязняющим мицелий, является кальций, однако присутствуют и другие металлы, например Fe⁺², Ni⁺², S, P и др. (фиг. 1, 1).

Загрязнение мицелия A.niger кристаллическими примесями подтвердил микроскопический контроль биомассы, которая имеет темно-серый цвет. Отмеченные загрязнения значительно мешают получению ХГК, поэтому в предлагаемом нами способе первоначально их удаляют кратковременной обработкой разведенной соляной кислотой. Далее для удаления цитоплазматического содержимого мицелия биомассу гриба обрабатывают детергентом, слабой щелочью и спиртом. Такое сочетание реагентов позволяет в течение короткого времени удалить клеточные биополимеры мицелия (белки, сложные липиды), нарушив их ковалентные и ионные связи с хитином и глюканом. Проводимая далее щелочная обработка благодаря использованию указанных выше реагентов позволяет проводить деацетилирование хитина в менее жестких условиях и снизить концентрацию щелочи до 20%, т.е. в два раза.

Полученный целевой продукт подвергают отмывке в спиртах понижающейся концентрации (от 96% до 30%), что позволяет значительно сократить расход воды при отмывке препарата от щелочи и значительно убыстрить эту процедуру, сократив время с 2-3 до 1 часа. Конкретная методика предлагаемого способа получения ХГК приведена в примере 1.

Пример 1.

Биомассу A. niger, полученную после ферментации на заводе с целью получения лимонной кислоты, подвергают обработке 2 н. соляной кислотой из расчета на 200 г отжатой биомассы 1 л кислоты в течение 15-20 мин при t= 45-50^oC. После отмывки водой получают мицелий, зольность которого составляет всего 0,8% (вместо 14% в исходной биомассе) (фиг. 1,2). Далее биомассу обрабатывают смесью реагентов, содержащих 0,1% детергента (стиральный порошок "Лотос"), 1% этанола (96%), 2% NaOH их расчета к биомассе (3:1) при t=98^oC в течение 35-45 минут. После отмывки водой продукт повергают воздействию 20% NaOH при t= 100-110^oC в течение 1 часа. Полученный ХГК отмывают от щелочи спиртами понижающейся концентрации: 96%, 70%, 50%, 30% и далее водой. Конечный продукт подвергают лиофильной сушке.

Полученный продукт белого цвета, имеет зольность 0,8%, не содержит ионов K, Fe, S и Cl. Из металлов в нем присутствует только Ca⁺² в количестве 0,68%. Вес полученного продукта составляет 38,3% от биомассы, очищенной от неорганических кристаллов. Целевой продукт содержит 15-17% глюкана и 37-38% деацетилированного хитина. ИКС целевого продукта имеет характерные для полиаминосахаридов полосы в области 1100, 1400, 1550 и 1680 сл^-1 и более сглаженную структуру пиков в области 1100-1400 сл^-1, что более характерно для хитозана, чем для хитина. Степень деацетилирования (СД) - 10-15%.

Пример 2.

То же, что в примере 1, но процесс деацетилирования ХГК проводят 25% NaOH в течение 2 часа • (t=110^oC). Целевой продукт содержит 52,5% глюкана и 25,0% деацетилированного хитина с СД=55%. Выход целевого продукта 35,0%. ИКС целевого продукта представлен на фиг. 2
Пример 3.

То же, что в примере 1, но процесс деацетилирования ведут первоначально с использованием 25% щелочи (из расчета на 16 г сырой биомассы 100 мл щелочи) в течение 45 мин при t =110^oC, далее после отмывки щелочи процедуру деацетилирования повторяют второй раз в тех же условиях, но расход щелочи уменьшают в два раза. СД целевого продукта составляет 65-70%, выход хитозана - 27,3%, глюкана - 56,7%, выход целевого продукта - 37,0. ИКС целевого продукта представлен на фиг. 3.

Таким образом, предлагаемый способ является более универсальным, так как учитывает использование при ферментации A.nigеr дешевых отходов, в частности мелассы. Кроме того, предобработка биомассы слабой кислотой и далее комплексом указанных выше 3-х реагентов позволяет значительно сократить в дальнейшем концентрацию щелочи (с 40% до 20-25%) и время обработки ( с 6 час до 2,0 - 2,5 час) при проведении процесса, а также расход воды при отмывке биомассы от щелочи за счет применения спиртов понижающейся концентрации, т.е. сделать процесс получения ХГК экологически более чистым. В способе предлагаются также условия, которые позволяют получать ХГК с различным содержанием глюкана и хитина, а также варьировать СД последнего.

Источники информации
1. Muzzarelli R.//Chitosan-glucan complex, method for its production and uses. US Patent, N 4, 368;322 1983 (прототип).

2. Muzzarelli R///Chitosan-glucan complex, method for its production and uses, US Patent, 4, 282, 351, 1981.

3. Muzzarelli R. //Chitin-Glucan complexes UK Patent Application, N 2026516 A., 1979.

4. Тесленко А. Я., Купцова Н.И., Гирфанова Т.Ф. и др.// Биотехнология, 1986, N 2, с. 80.

5. Muzzarelli R. , Tanfani F., Scarpini G.//Biotechnology and Bioengineering, 1980, v.22, P.885.

6. Доклады Болг. АН, 1990. Т.43. N 10. C.69.

Использование: биотехнология, производство лимонной кислоты. Сущность изобретения: описан способ получения хитозанглюканового комплекса с содержанием глюкана и хитозана от 25 до 60% и степенью деацетилирования от 15 до 70%. Для этого биомассу Aspergillus niger обрабатывают 2 н. соляной кислотой, далее смесью реагентов (детергентом, слабой щелочью, этанолом) при 96^oC в течение 35-45 мин. Деацетилирование ведут 20-25% щелочью в течение 1-2 ч при температуре 100-110^oC. Далее целевой продукт отмывают от щелочи спиртами с понижающимися концентрациями и водой. Предлагаемый способ получения хитозанглюканового комплекса является по сравнению с аналогами более быстрым, универсальным и экологически более чистым. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения хитозанглюканового комплекса, включающий культивирование гриба Aspergillus niger с последующей обработкой мицелия разведенным и концентрированным растворами NaOH, отмывку от щелочи и лиофильную сушку целевого продукта, отличающийся тем, что полученный после культивирования мицелий предварительно подвергают воздействию 2 н соляной кислоты, затем обрабатывают смесью, содержащей 0,1% детергента, 1% этанола (96%) на основе 2%-ного раствора NaOH при соотношении комплекса реагентов и мицелия 3:1, в качестве концентрированного раствора NaOH используют его 20-25%-ный раствор и обработку ведут 1 - 2 ч. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отмывку мицелия от щелочи осуществляют последовательно растворами, содержащими 96%, 70%, 50% и 30% спирта.