ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ХИТИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ЛАМИНАРИНАЗЫ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12N9/36 C12N9/36 C12R1/07 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новое свойство уже известного штамма [1], который может быть использован для получения ферментных препаратов, гидролизующих хитин, хитозан и клеточные стенки мицелиальных грибов.

Известна способность многих бактерий к образованию хитинолитических ферментов. Среди них наиболее часто встречаются представители родов Serratia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Aeromonas и другие [2]. Например, известный штамм - продуцент хитиназы Streptomyces kurssanovii, согласно описанию [3] , продуцирует 0,45 ед. активности на 1 мл культуральной жидкости (1 ед. - 1 мкМ N-ацетил-D-глюкозамина, образующийся за 1 мин под действием 1 мл фермента). Другой известный штамм Serratia marcescens [4] обеспечивает выход хитиназы с активностью 0,3-0,5 ед./мл. Однако Serratia marcescens принадлежит к условно патогенным микроорганизмам, и, в силу этого, промышленное применение данного штамма небезопасно как для обслуживающего персонала, так и для окружающей среды. В то же время широко известно использование бацилл для получения различных ферментных препаратов, применяемых в пищевой и легкой промышленности [5].

Известно также, что бактериальные препараты хитиназы способны вызывать лизис клеточных стенок мицелиальных грибов. Однако эффективность действия многих известных препаратов довольно низка, что связано со сложным составом грибной клеточной стенки. Известен, например, штамм Streptomyces viridificans, продуцирующий хитиназу [6]. Ферментный препарат, полученный на основе этого штамма, способен лизировать клеточные стенки нескольких видов мицелиальных грибов с активностью, колеблющейся в пределах 0,07-0,09 ед./мл (1 ед. здесь определяется как образование 1 мкМ N-ацетил-D-глюкозамина за 1 час на 1 мл реакционной смеси). Более эффективны в этом отношении бациллярные препараты [7, 8].

Основная цель изобретения - использование штамма Bacillus sp. 739, запатентованного ранее как антагониста некоторых фитопатогенных грибов, в новом качестве, для получения комплексного ферментного препарата с хитинолитической и миколитической активностью.

Штамм Bacillus species 739 депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 132.

Штамм характеризуется следующими признаками:
Спорообразующие, грам-положительные, палочковидные подвижные клетки, размером 0,5-0,8 на 2,0-4,0 мкм. Спорообразование субтерминальное, споры эллиптические, раздувают клетку.

Морфологические признаки
На среде с мясопептонным агаром образует слизистые, выпуклые, непрозрачные колонии кремового цвета диаметром 2-3 мм, принимающие затем складчатую форму с высоким бортиком по краю и достигающие 4-6 мм. Около 10% колоний остается гладкой, не увеличиваясь в размерах. На картофельном агаре формируются мелкие слизистые колонии, выпуклые и непрозрачные, диаметром 1-2 мм. На третьи сутки колонии трансформируются в складчатые, незначительно увеличиваясь в размерах до 3-4 мм в диаметре.

На агаризованной среде, содержащей 0,5% коллоидного хитина, 0,1% КН₂РO₄, (NH₄)₂HPO₄, 0,05% MgSO₄•7H₂O, 0,3% пептона, 0,1% кукурузного экстракта и 1,6% агар-агара в дистиллированной воде, через 24 ч инкубации при 37^oС штамм образует мелкие (1-2 мм) слизистые, приподнятые над поверхностью колонии кремового оттенка. Зоны гидролиза коллоидного хитина в агаре формируются ко 2-м суткам инкубации. К 6-7-м суткам инкубации размер колоний достигает 3-5 мм в диаметре, ореолы просветления начинают сливаться друг с другом. Преобладают колонии одного морфологического типа.

На жидкой картофельно-глюкозной среде образует слизистый осадок.

Физиолого-биохимические признаки:
Штамм усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, маннит, глицерин, этанол. При сбраживании сахаров газа не образует. Гидролизует крахмал. В качестве источника азота усваивает как органические формы (пептоны, автолизаты, экстракты), так и минеральные (соли аммония, нитраты). На безазотистой среде Эшби рост слабый. При использовании в качестве единственного источника азота KNO₃ или NaNO₃ в жидкой культуре выделяют большое количество полисахаридов, вплоть до гелеообразного состояния. На средах с крахмалом образует кристаллы циклодекстринов. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует. Аэроб. Хорошо растет в интервале температур от 30 до 45^oС. Растет в интервале рН 5,0-8,5. По физиолого-биохимическим характеристикам штамм не соответствует ни одному из описанных в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology и идентифицирован, как Bacillus sp. 739 [9].

Штамм хранится на косяках картофельного агара или в лиофильно высушенном состоянии.

Было выявлено, что при культивировании штамма Bacillus sp. 739 на средах с хитином в качестве основного источника углерода, в культуральной жидкости обнаруживается достаточно высокая активность внеклеточных хитиназы, ламинариназы и хитозаназы, что делает возможным его использование для получения препаратов миколитического действия.

Пример 1. Штамм выращивают в жидких питательных средах А и Б следующего состава, г/л дистиллированной воды:
Среда А:
Коллоидный хитин - 2,0
Пептон - 2,0
Кукурузный экстракт - 1,0
КН₂РO₄ - 1,0
(NH₄)₂HPO₄ - 1,0
MgSО₄•7H₂O - 0,5
Среда Б
Кукурузный крахмал - 2,0
Пептон - 2,0
Кукурузный экстракт - 1,0
КН₂РO₄ - 1,0
(NH₄)₂HPO₄ - 1,0
MgSO₄•7H₂O - 0,5
Коллоидный хитин добавляют в среду в виде густой пасты в расчете сухого содержания субстрата на 100 мл среды. Выращивание штамма осуществляют в колбах объемом 250 мл на качалке УВМТ-12 при 37^oС и 160 об•мин^-1. Время культивирования 72 ч.

Количественно хитинолитическую активность измеряют следующим образом. Пробы культуральной жидкости, по 0,1-0,2 мл, разбавляют до 1 мл фосфатно-цитратным буфером (0,05 М, рН 6,0) и инкубируют с 0,5 мл 1%-ной суспензии коллоидного хитина в том же буфере при 50^oС. Время инкубации составляет один час. По окончании реакции негидролизованный субстрат удаляют центрифугированием и определяют концентрацию восстанавливающих сахаров в супернатанте. За единицу хитинолитической активности принимают количество фермента, гидролизующего хитин с высвобождением 1 мкМ N-ацетил-D-глюкозамина в минуту на 1 мл реакционной смеси. Концентрацию сахаров определяют феррицианидным методом [10] по калибровочному графику с N-ацетил-D-глюкозамином в качестве стандарта. Результаты представлены в таблице.

Пример 2. Штамм Bacillus sp. 739 выращивают в условиях периодической ферментации, как в примере 1 на среде А, и определяют хитиназную, хитозаназную и ламинариназную активности. Динамика накопления ферментативных активностей представлена на фиг. 1.

Активность хитозаназы измеряют при тех же условиях, что и активность хитиназы, используя в качестве субстрата коллоидный хитозан со степенью дезацетилирования около 80%. За единицу активности принимают количество фермента, образующее 1 мкМ D-глюкозамина в минуту на 1 мл реакционной смеси. Концентрацию сахаров определяют феррицианидным методом по калибровочному графику с D-глюкозамином в качестве стандарта.

Ламинариназную активность определяют следующим образом. Пробы культуральной жидкости разбавляют до 0,5 мл фосфатно-цитратным буфером (0,05 М, рН 6,0) и инкубируют с 0,5 мл 0,2%-ного раствора ламинарина при 50^oС. Время инкубации составляет десять минут. Реакцию останавливают добавлением 3 мл феррицианидного реагента. За единицу ламинариназной активности принимают количество фермента, гидролизующее субстрат с высвобождением 1 мкМ D-глюкозы в минуту на 1 мл реакционной смеси. Концентрацию сахаров определяют феррицианидным методом по калибровочному графику с D-глюкозой в качестве стандарта.

Пример 3. Штамм Bacillus sp. 739 выращивают как в примере 1. Культуральную жидкость подвергают центрифугированию для отделения биомассы. Из супернатанта сульфатом аммония (65% от насыщения) осаждают сырой препарат ферментов и диализуют против фосфатно-цитратного буфера (рН 6,0).

В колбы, содержащие раствор сырого препарата фермента в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере (рН 6,0) в количестве ~0,5 ед./мл, вносят 1% (с/в) мицелия грибов и инкубируют при 37^oС. Отбор проб для определения концентрации редуцирующих сахаров производят через равные промежутки времени. Сахара определяют феррицианидным методом с N-ацетил-D-глюкозамином в качестве стандарта. Результаты, характеризующие мико-литическую активность препарата, представлены на фиг. 2.

Источники информации
1. Патент 1743019 Россия, А 01 N 63/00, С 12 N 1/20. Штамм бактерий Bacillus sp. для получения препарата против грибных возбудителей болезней злаковых культур /А.И.Мелентьев, Н.Г.Усанов, О.Н.Логинов. Заявл. 03.10.89. Опубл. 23.03.93.

2. Тиунова Н.А. Хитинолитические ферменты микроорганизмов // Успехи биологической химии. - 1989. - Т. 30. - С. 199-219.

3. Патент 2061754 Россия, С1, С 12 N 9/36. Штамм Streptomyces Kurssanovii - продуцент хитиназы и N-ацетил-D-глюкозаминидазы / Н.Ю. Татаринова, О.С. Гринченко, В.П.Варламов. Заявл. 31.12.1992. Опубл. 10.06.1996.

4. Патент 2026348 Россия, C1, C 12 N 9/36. Штамм бактерий Serratia marcescens - продуцент хитиназы / З.И. Панфилова, А.Б. Дужак, Р.И. Салганик. Заявл. 08.05.1992. Опубл. 01.09.1995.

5. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. // Bacteriol. Reviews. - 1977. -V. 41. -P. 711-753.

6. Gupta R., Saxena R., Chaturvedi P., Virdi J. Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis. // J. Appl. Bacteriol. -1995. -V. 78.-P. 378-383.

7. Horikoshi К., Iida S. Lysis of fungal mycelia by bacterial enzymes. // Nature. - 1958. -V. 181, 4613. - Р. 917-918.

8. Podile A.R., Prakash A.P. Lysis and biological control of Aspergillus niger by Bacillus subtilis AF1. // Can. J. Microbiol. - 1996. - V. 42. - P. 533-538.

9. Bergey's manual of systematic bacteriology. - Baltimore: Williams and Wilkins Co., 1986. -P. 1104-1141.

10. Синицин А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов // Итоги науки и техники: Биотехнология. - 1993. - Т.25. - С. 33.

Изобретение относится к биотехнологии. Обнаружено у ранее выделенного штамма-антагониста Bacillus sp. 739 новое качество - способность к образованию комплекса внеклеточных хитинолитических ферментов, включающего хитиназу, хитозаназу и ламинариназу. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 132. Морфологические признаки культуры изучались на средах с мясопептонным и картофельным агаром. В первом случае штамм образует слизистые, выпуклые, непрозрачные колонии, принимающие затем складчатую форму с высоким бортиком по краю. На картофельном агаре формируются мелкие слизистые колонии, выпуклые и непрозрачные. На третьи сутки колонии трансформируются в складчатые. Аэроб. Хорошо растет в интервале температур от 30 до 45^oС. Штамм усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, маннит, глицерин, этанол. При сбраживании сахаров газа не образует. Гидролизует крахмал. На средах с крахмалом образует кристаллы циклодекстринов. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. Индол не образует. Растет в интервале рН 5,0-8,5. По физиолого-биохимическим характеристикам штамм не соответствует ни одному из описанных в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology и идентифицирован как Bacillus sp. 739. Общая хитиназная активность в культуральной жидкости 0,15-0,20 единиц на 1 мл. Активность хитозаназы и ламинариназы составляет, соответственно, около 0,10 и 2,0-2,5 единиц на 1 мл культуральной жидкости. Данный ферментный препарат способен активно лизировать клеточные стенки некоторых мицелиальных грибов. 1 табл., 2 ил.

Применение штамма Bacillus sp. ВНИИСХМ 132 в качестве продуцента комплекса хитинолптических ферментов и ламинариназы.