СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СРЕДСТВА Российский патент 2001 года по МПК A23L1/29 A23L1/30 A61K35/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения биологически активного общеукрепляющего средства.

В настоящее время в результате массированного загрязнения окружающей среды наблюдаются изменения в течении симптомов заболеваний и в связи с этим падает эффективность многих традиционных методов диагностики, средств и методов лечения. Поэтому в настоящее время в медицине уделяется усиленное внимание медико-экологической реабилитации населения, направленной на снижение патологических процессов, вызванных неблагоприятным экологическим фоном [1]. В этом отношении наибольшая эффективность в восстановлении здоровья создается совместным применением фармакологических препаратов и биологически активных природных средств.

Среди последних наибольшее внимание в настоящее время привлекает каротиноид ликопин, обладающий особыми лечебно-профилактическими свойствами. Ликопин представляет собой C₄₀-изопреноид, имеющий темно-красную окраску. Этот каротиноид распространен среди многих растений, однако наибольшее его количество содержится в томатах. Много ликопина находится также в мицелии некоторых представителей мукоровых грибов, у которых этот каротиноид составляет до 1,5% от веса сухой биомассы [2].

Первоначально ликопин привлек внимание как окрашивающее средство для пищевой промышленности, где этот каротиноид заменил собой ряд синтетических красителей, небезопасных для здоровья (потенциальных канцерогенов).

В последние годы ликопин пользуется особым вниманием медиков в связи с тем, что его антиоксидантная активность выше чем у β-каротина. Известно, что развитие целого ряда заболеваний сопровождается активацией свободнорадикального окисления и приводит к перекисному окислению липидов (ПОЛ), что лежит в основе патогенеза [3]. Это обстоятельство служит основой поиска ингибиторов ПОЛ, среди которых наибольшее применение в последнее время получил ликопин [4]. Вероятно, это свойство ликопина объясняет установленную закономерность, состоящую в том, что люди, употребляющие пищу, богатую ликопином, менее подвержены заболеванию раком простаты [5]. Есть также данные о том, что ликопин может задерживать развитие рака поджелудочной железы и, возможно, желудка [4]. Все сказанное свидетельствует о том, что использование ликопина как биологически активного средства необходимо для поддержания жизненного статуса.

Известны несколько способов извлечения ликопина из природных объектов [в частности из томатов [6, 8] и из мицелия мукоровых грибов (+) и (-) штаммов Blakeslea trispora [2, 7]. Ликопин из томатов Lycopersicum esculentum [8] получают путем обезвоживания биомассы, центрифугированием, экстракцией н-гексаном с добавлением фосфолипидов из сои, отделением растворителя, повторной экстракцией н-гексаном. Дополнительная очистка проводится на колонке с окисью алюминия и элюцией продукта смесью ацетона с гексаном.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения и извлечения ликопина [2], согласно последнему продуцентами синтеза ликопина являются Т (+) и Т (-), ВКМ F-904 (+), ВКМ F-903 (+), ВКМ F-812 (+) штаммы Blakeslea trispora. Штаммы выращивают раздельно, а затем совместно на питательной среде. В качестве посевного материала используют спорангиоспоры, соотношение посевных (+) и (-) мицелиев составляет 1:7, выращивание осуществляют в более аэробных условиях в течение 86-92 часов, а подсолнечное масло для выращивания используется в количестве 5%. Выход ликопина составляет 1,3-1,5 г/л. Для получения кристаллического ликопина проводят экстракцию биомассы горячим (85^oC) подсолнечным маслом. После кристаллизации при охлаждении промывают препарат этанолом. Дальнейшая очистка ведется перекристаллизацией из толуола кипящим абсолютным этанолом. Получают 97% ликопин. Для получения ликопина, не содержащего примесей других каротиноидов, используют колоночную хроматографию на окиси алюминия.

Недостатком данного способа является длительность и трудоемкость извлечения ликопина из биомассы (+) и (-) штаммов В. trispora, низкая извлекаемость ликопина при использовании подсолнечного масла, потери при последующей перекристаллизации, что приводит к значительному уменьшению выхода конечного продукта. Кроме того, при таком способе извлечения ликопина происходит потеря ряда биологически активных соединений, содержащихся в липидных глобулах мицелия, в которых растворен ликопин. Эти нейтральные липиды, биологическая ценность которых состоит не только в том, что они содержат более 50% эссенциальной жирной кислоты C_18:2, но и в наличии пальмито-олеиновой кислоты (C_16:1), защищающей мембраны от стрессовых воздействий. Кроме того, в липидных глобулах гриба наряду с ликопином, содержатся убихиноны и другие природные антиоксиданты.

Технический результат изобретения заключается в разработке более эффективного и менее трудоемкого способа извлечения ликопина из мицелия грибов. Кроме того, способ позволяет одновременно извлекать ряд других биологически ценных соединений (липидов, содержащих линолевую кислоту, убихинонов и других антиоксидантов). Тем самым, увеличивается биологическая ценность извлекаемого продукта, который предлагается использовать как общеукрепляющую пищевую добавку, обладающую антиоксидантными и адаптогенными свойствами.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что после выращивания продуцента извлечение ликопина ведут из лиофилизированной биомассы, которую подвергают измельчению. Экстракцию осуществляют дважды по 30 минут хлороформом, и объединенный экстракт упаривают до получения концентрированной суспензии ликопина, которую сушат в вакууме до отрицательной реакции на ионы хлора. Выход ликопина - 85-90% от исходного содержания. Полученный концентрат ликопина (КЛ) содержит 3,0-3,5% ликопина. КЛ смешивают с растительным маслом до получения 2%-ной суспензии ликопина, из которой путем капсулирования получают биологически активное средство "Миколикопин".

Кроме того, КЛ может быть использован для получения других лечебно-профилактических препаратов в виде капсул, драже, растворов и таблеток. Примеры конкретного выполнения способа извлечения ликопина.

Пример 1. 150 г лиофилизированной биомассы подвергают измельчению в гомогенизаторе. Измельченную биомассу дважды экстрагируют хлороформом (1:5) в течение 30 минут при соотношении биомасса:хлороформ = 1:8. Экстракцию ведут в атмосфере азота при интенсивном перемешивании (обороты мешалки - 180-200 об/мин). Биомассу отделяют фильтрованием и полученные экстракты объединяют. Далее объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе и удаляют следы хлороформа под вакуумом до отрицательной реакции на ионы хлора, используя качественную реакцию с медной проволокой. Выход ликопина составляет 85-90%.

Для получения биологически активного средства, называемого "Миколикопином", к КЛ добавляют растительное масло (например масло подсолнечное рафинированное дезодорированное ГОСТ 1129-93) до получения 2% суспензии ликопина и на этой основе готовят желатиновые капсулы. Капсулы вырабатывают с использованием желатиновой массы в капсуляторах для формирования капсул типа "Глобекс". Средняя масса капсул (в граммах) - 0,31±0,04, содержание ликопина в капсуле - 0,04-0,06 г. Спектрофотометрические характеристики ликопина (в гексане): три максимума поглощения при 443±4, 471±4, 502±4 нм. Капсулы имеют сферическую, яйцевидную или продолговатую форму, поверхность гладкая, без повреждений, цвет от темно-вишневого до коричневого.

Пример 2. То же, что в примере 1, но экстракцию ликопина ведут из сырой биомассы. Выход ликопина 65-70% от исходного содержания.

Пример 3. То же, что в примере 1, но экстракцию ликопина ведут из сырой замороженной биомассы. Выход ликопина - 60-65%.

Пример 4. То же, что в примере 2, но для большего извлечения ликопина используют дополнительную обработку (гомогенизацию) биомассы с Na₂SO₄. Выход ликопина 70-73%.

Пример 5. То же, что в примере 1, но для извлечения ликопина используют ацетон. Выход ликопина - 60-65%.

Пример 6. То же, что в примере 1, но для извлечения ликопина используют гексан. Выход ликопина - 60-65%.

Проведенное доклиническое изучение безопасности капсул "Миколикопина" в лаборатории лекарственной токсикологии ВИЛАР свидетельствует о низкой токсичности и отсутствии противопоказаний для его применения в рекомендованных дозах. В лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов НИИЭД и ТО РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН проведены испытания, показавшие, что "Миколикопин" кроме антиоксидантного, обладает антимутагенным эффектом, радиопротекторным, иммуномодулирующим действием. Причем радиопротекторное действие "Миколикопина" практически в 2 раза выше, чем суспензии кристаллического (очищенного до 95%) ликопина в растительном масле.

Таким образом, данный способ позволяет значительно повысить выход ликопина (до 93%) за счет использования нового способа извлечения ликопина из биомассы продуцента и создать новое биологически активное средство, обладающее антиоксидантным, радиопротекторным, антимутагенным и иммуномодулирующим эффектами, которое можно использовать и как биологически активную добавку (БАД) к пище. Следует особо отметить, что, благодаря присутствию в "Миколикопине" дополнительных соединений липидной природы, образуемых продуцентом, это средство проявляет более выраженное протекторное действие при неблагоприятных воздействиях, например, при γ- облучении, чем средство, сделанное на основе кристаллического ликопина.

Литература
1. Вольфович Д.П., Куликова В.П., Прокопенко Ю.И. 2000. Новые препараты БАД фирмы "Битра" на основе автолизата пивных дрожжей //Журнал международной академии авторов научных открытий, май-июнь, c. 31-34.

2. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С. 1998. Способ получения ликопина. Патент РФ N 2115678, C 09 B 61/00, 20.07.98.

3. Клебанов Г. И., Капитанов А.Б., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. и др. 1998. Антиоксидантные свойства ликопина //Биологические мембраны. Т. 15. N 2. С. 227-237.

4. Gerster H. 1997. The potential role of lycopene for human health //J. Am. College of Nutrition. V. 16. N 2. P. 109-126.

5. Glowannucci E., Clinton S.K. Tomatoes, lycopene, and prostate cancer //Proc. Soc. Exp. Biol. Med., V. 218, N 2, P. 1229-139.

6. Капитонов А. Б., Пименов А.М., Нестерова О.А., Сергеенко В.И. 1994. Способ профилактики и лечения атеросклероза. Патент РФ N 95113015.

7. Ивакин А.Ф., Феофилова Е.П., Киселева А.И., Панова И.А., Зырянов В.В. и др. 1995. Способ получения ликопина. Патент РФ N 2102416.

8. Seshizzi P., Morazzoni P.A process for the extraction of lycopene and extract containing it. EP 0818225 A1.

Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в частности при получении биологически активного общеукрепляющего средства. Для получения средства ликопинсодержащую биомассу лиофилизируют с последующим ее измельчением. Затем проводят экстрагирование биомассы хлороформом дважды в течение 30 мин при соотношении биомасса : хлороформ = 1 : 8 в атмосфере азота при интенсивном перемешивании. Экстракты объединяют и проводят пробу на отсутствие следов хлороформа. Концентрат ликопина смешивают с растительным маслом и полученную 2%-ную суспензию капсулируют. Способ позволяет получить добавку, обладающую антиоксидантными и адаптогенными свойствами, увеличить ее биологическую ценность, повысить эффективность способа и снизить трудоемкость.

Способ получения биологически активного средства, включающий получение ликопинсодержащей биомассы, ее экстрагирование и концентрирование, отличающийся тем, что ликопинсодержащую биомассу лиофилизируют с последующим ее измельчением, экстрагирование биомассы осуществляют дважды хлороформом в течение 30 мин при соотношении биомасса: хлороформ = 1 : 8 в атмосфере азота при интенсивном перемешивании, экстракты объединяют, концентрат ликопина смешивают с растительным маслом и полученную 2%-ную суспензию капсулируют.