СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЛИКОПИНА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/14 C12P23/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению биологически активного средства на основе ликопина.

Ликопин представляет собой ациклический каротиноид, который содержит 11 конъюгированных двойных связей, расположенных линейно в all-trans конфигурации, что определяет его высокую антиоксидантную активность.

Известен способ получения ликопина из мицелия мукорового гриба Blakeslea trispora Thaxter (Патент РФ №2102416, МПК С09В 61/00, опубл. 1998 г.). Штаммы А-732-3(+) и А-732-2(-) [7] (+)8 и (-)8А [8] выращивают раздельно в течение 48 ч на гидролизной мучной среде. Далее (+) и (-) штаммы в соотношении 1:9 вносят в ферментационную мучную среду, добавляют 1% табачной крошки или 2-амино-6-метилпиридин в количестве 0,005% и культивирование продолжают в течение 3 суток при температуре 27-28°С. Выход ликопина составляет по данным спектрофотометрического метода 0,4-0,7 г/л. Полученную ликопинсодержащую биомассу сушат и экстрагируют по принципу противотока подсолнечным маслом при соотношении биомасса:масло (1:1) при 85°С в течение 30 мин. Для кристаллизации ликопина насыщенный экстракт выдерживают при 12-15°С в течение 3 суток. Кристаллы отделяют отстаиванием и получают 0,8%-ную суспензию кристаллического ликопина в масле. Далее их дважды промывают этанолом в соотношении 1:5 при 50° и получают кристаллы, содержащие 47% ликопина. Дальнейшая очистка производится перекристаллизацией из толуола кипящим абсолютным этанолом. В результате получают кристаллический 97% ликопин.

Недостатком этого способа является низкий выход ликопина (0,4-0,7 г/л), неэффективная экстракция ликопина из биомассы подсолнечным маслом и жидкой питательной средой с подсолнечным маслом и использование в качестве стимулятора ликопиногенеза никотинсодержащей табачной крошки, что мешает экстракции ликопина.

Известен способ получения ликопина (Патент РФ №2115678, МПК С09В 61/00, опубл. 1998 г.) с использованием более продуктивных штаммов-мутантов и посевного материала в виде спорангиоспор, стимулятора ликопиногенеза 2-амино-6-метил-пиридина (0,005%) и нового соотношения гетероталличных штаммов гриба-продуцента (1:7) при совместном культивировании. Выход ликопина составляет 1,3-1,5 г/л.

Недостатком этого способа является невысокий выход конечного продукта, поскольку возможны большие потери всхожести спорангиоспор при их длительном хранении.

Известен способ получения ликопина, а также фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина из биомассы мутантных штаммов Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+) без применения стимуляторов (Патент РФ № 2270868, МПК С12Р 23/00, опубл. 2006 г.). Раздельное выращивание штаммов ведут на мучной среде, а совместное - на минеральной среде с глюкозой и пептоном или отходами крахмалопаточного производства - гидролом и кукурузным экстрактом. Метод позволяет последовательно выделить ликопин (экстракция гидрофобным растворителем), фосфолипиды, жирные кислоты и эргостерин. Выход ликопина составляет 40-50 мг/г от сухой биомассы.

Недостатком метода является существенная потеря ликопина при экстракции гидрофобным растворителем (28-30%).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому способу является способ получения биологически активного средства (Патент РФ № 2166868, МПК A23L 1/29, 1/30, опубл. 2001 г.), включающий выращивание спорангиоспор на твердой питательной среде, использование спорового посевного материала для раздельного выращивания (+) и (-) мицелиев гриба Blakeslea trispora, а далее совместно их выращивают в жидкой питательной среде с подсолнечным маслом и стимулятором ликопиногенеза 2-амино-6-метил-пиридином, полученную ликопинсодержащую биомассу лиофильно сушат, измельчают, экстрагируют хлороформом, полученный экстракт концентрируют, смешивают концентрат с подсолнечным маслом, капсулируют - получают Миколикопин.

Продуцентами ликопина являются Т(+) и Т(-), ВКМ F-904(+), BKM F-903(+), BKM F-812(+) штаммы Blakeslea trispora. Выход ликопина составляет 1,3-1,5 г/л.

Недостатком этого способа получения ликопинсодержащей биомассы является нестандартность выходов ликопина, обусловленная снижением активности спорового посевного материала, что уменьшает уровень ликопина и, следовательно, уменьшает количество полученного биологически активного средства.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков и повышение выхода биологически активного средства за счет роста уровня ликопина и увеличения срока хранения и всхожести спорового посевного материала, что также повышает уровень выхода конечного продукта.

В предлагаемом способе получения биологически активного средства, включающем выращивание спорангиоспор на твердой питательной среде, использование спорового посевного материала для раздельного выращивания (+) и (-) мицелиев гриба Blakeslea trispora, а далее совместное их выращивание в жидкой питательной среде с подсолнечным маслом и стимулятором ликопиногенеза 2-амино-6-метил-пиридином, затем полученную ликопинсодержащую биомассу лиофильно сушат, измельчают, экстрагируют хлороформом, полученный экстракт концентрируют, смешивают концентрат с подсолнечным маслом, капсулируют, новым является то, что спорангиоспоры выращивают на твердой питательной среде с добавлением трегалозы в количестве 0,5-1,5% в течение 5-7 дней, при этом в терминальной фазе спорогенеза осуществляют воздействие зеленым светом с длиной волны 530 нм и интенсивностью облучения 1,3-1,7 кВт/м², а при совместном выращивании (+) и (-) мицелиев гриба Blakeslea trispora берут их и используют соотношение (+) и (-) штаммов 1:7, причем вносят в жидкую питательную среду 0,10-0,20% антиоксиданта 6-метил-2-этил-3-оксипиридина.

Получение посевного материала в виде спорангиоспор на твердой среде с добавлением 0,5-1,5% трегалозы - дисахарида, способствующего у грибов поддержанию состояния покоя, приводит к сохранению жизнеспособности спорангиоспор в течение 3-х месяцев, быстрой и синхронной всхожести спорангиоспор при прорастании.

Такой прием необходим, потому что, в отличие от грибов аскомицетного аффинитета, спорангиоспоры В. trispora быстро (в течение месяца) утрачивали состояние покоя, что приводило к ухудшению качества посевного материала и резкому снижению выходов ликопинсодержащей биомассы при ферментациях.

При освещении зеленым светом с длиной волны 530 нм (1,3-1,7 кВт/м²) в терминальной стадии спорогенеза у гетероталличных штаммов гриба образуются споры, содержащие больше липидов и обогащенные фосфолипидом фосфатидилхолином, который способствует более длительному сохранению активного спорового материала. В то же время использование зеленого света в процессе спорогенеза позволяет в значительной степени (в 2 раза) увеличить выход спор, используемых в качестве посевного материала для биотехнологического способа получения ликопина.

Предлагаемый способ позволяет улучшить биотехнологию получения ликопина, выход этого каротиноида увеличивается на 15-22% за счет того, что в процессе ферментации наряду со стимулятором ликопинообразования 2-амино-6-метил-пиридином (0,005%) используют, вводят антиоксидант - 6-метил-2-этил-3-оксипиридин, который обладает аддитивным действием и активирует дополнительно стимулирует процесс ликопинообразования.

Осуществление способа показано на конкретном примере.

Пример 1

Перед целевой ферментацией проводится специальная подготовка активного посевного материала гетероталличных штаммов с целью синхронизации и стабилизации процесса получения ликопина.

Для этого на твердой картофельно-морковной среде с добавлением 1,5% трегалозы раздельно выращивают (+)Т и (-)Т штаммы B.trispora в течение 7 суток при температуре 26-27°С. При этом при наступлении терминальной стадии спорогенеза культуру облучают зеленым светом, используя люминесцентные лампы с длиной волны 530 нм и интенсивностью облучения 1,3 кВт/м².

Далее из этих спор раздельно выращивают в течение 48 ч в жидкой питательной среде мицелии гетероталличных штаммов, которые затем используют для совместного выращивания (соотношение (+) и (-) штаммов - 1:7) в жидкой питательной среде, содержащей: муку соевую - 40, муку кукурузную - 17,3, KH₂PO₄ - 0,5, воду водопроводную - до 1 л, при посеве добавляют 5% подсолнечного масла, 0,005% стимулятора ликопиногенеза - 2-амино-6-метилпиридина и 0,15% антиоксиданта 6-метил-2-этил-3-оксипиридина.

Полученную биомассу лиофильно сушат, измельчают до размера частиц 1-3 мм в дезинтеграторе. Далее трехкратно экстрагируют хлороформом, растворитель удаляют на роторном испарителе, полученный концентрат смешивают с подсолнечным маслом для получения 2%-ной суспензии ликопина, из которой путем капсулирования получают биологически активное средство «Миколикопин». В одной капсуле содержится 5 мг ликопина в 0,2 мл масла.

Приведенная выше подготовка спорового посевного материала обеспечивает стабильность и синхронизацию его прорастания, что приводит к стандартизации посевного материала, и совместно с добавлением антиоксиданта к увеличению выхода конечного продукта на 22%. Таким образом, выход ликопина возрастает до 1,8 г/л, а стабильность ферментации составляет 97%.

Контрольная группа опытов показала, что без внесения антиоксиданта выход ликопина снижается до 1,5 г/л, а использование в течение 1 месяца посевного материала, выращенного без трегалозы и облучения зеленым светом, может привести к снижению выхода ликопина до 50%.

Пример 2

То же, что и в примере 1, но используются штаммы B.trispora Т(-) и ВКМ F-904(+). Выход ликопина составляет - 1,71 г/л.

Пример 3

То же, что в примере 1, но используются штаммы B.trispora T(-) и ВКМ F-812(+). Выход ликопина составляет - 1,76 г/л.

Пример 4

То же, что и в примере 1, но используются штаммы B.trispora Т(-) и ВКМ F-903(+). Выход ликопина составляет - 1,78 г/л.

Пример 5

То же, что в примере 1, но количество трегалозы в среде выращивания спорового посевного материала составляет 0,5%, интенсивность облучения зеленым светом составляет 1,5 кВт/м², количество вносимого антиоксиданта - 0,1%. Выход ликопина составляет 1,78%.

Пример 6

То же, что в примере 1, но количество внесенной трегалозы составляет 1,0%, интенсивность облучения 1,7 кВт/м², количество внесенного антиоксиданта - 0,20%. Выход ликопина составляет - 1,79%.

Таким образом, заявленное изобретение обеспечивает, благодаря указанным приемам получения посевного материала и введения антиоксиданта, стабильность выходов ликопина в ферментациях и увеличение выхода конечного продукта, например Миколикопина.

Технический результат изобретения заключается в разработке способа получения биологически активного средства с использованием спорового посевного материала с большим сроком хранения и лучшей всхожестью, что совместно с введением антиоксиданта приводит к оптимизации биотехнологии получения ликопина и увеличению выхода конечного продукта Миколикопина.

Способ включает выращивание спорангиоспор на твердой питательной среде с добавлением трегалозы в количестве 0,5-1,5% в течение 5-7 дней. При этом в терминальной фазе спорогенеза осуществляют воздействие зеленым светом с длиной волны 530 нм и интенсивностью облучения 1,3-1,7 кВт/м². Споровый посевной материал используют для раздельного выращивания (+) и (-) мицелиев гриба Blakeslea trispora. Затем осуществляют совместное их выращивание в жидкой питательной среде с подсолнечным маслом при соотношении (+) и (-) мицелиев 1:7, стимулятором ликопиногенеза 2-амино-6-метил-пиридином и 0,10-0,20% антиоксидантом 6-метил-2-этил-3-оксипиридином. Полученную ликопинсодержащую биомассу лиофильно сушат, измельчают, экстрагируют хлороформом. Полученный экстракт концентрируют, смешивают концентрат с подсолнечным маслом, капсулируют. Способ обеспечивает оптимизацию биотехнологии получения ликопина и увеличение выхода биологически активного средства. Выход ликопина составляет 1,17-1,8%.

Способ получения биологически активного средства на основе ликопина, включающий выращивание спорангиоспор на твердой питательной среде, использование спорового посевного материала для раздельного выращивания (+) и (-) мицелиев гриба Blakeslea trispora, а далее совместное их выращивание в жидкой питательной среде с подсолнечным маслом и стимулятором ликопиногенеза 2-амино-6-метил-пиридином, далее полученную ликопинсодержащую биомассу лиофильно сушат, измельчают, экстрагируют хлороформом, полученный экстракт концентрируют, смешивают концентрат с подсолнечным маслом, капсулируют, отличающийся тем, что спорангиоспоры выращивают на твердой питательной среде с добавлением трегалозы в количестве 0,5-1,5% в течение 5-7 дней, при этом в терминальной фазе спорогенеза осуществляют воздействие зеленым светом с длиной волны 530 нм и интенсивностью облучения 1,3-1,7 кВт/м², а при совместном выращивании (+) и (-) мицелиев гриба Blakeslea trispora берут штаммы при соотношении (+) и (-) как 1:7, а в жидкую питательную среду вносят 0,10-0,20% антиоксиданта 6-метил-2-этил-3-оксипиридина.