СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДОВОГО (ВИДОВОГО) СОСТАВА АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения родового (видового) состава экологических, биотехнологических и инфекционных сообществ микроорганизмов.

Известные способы определения таксономической принадлежности отдельных микроорганизмов в сообществах, например микробных ассоциаций экологических ниш, очистных сооружений или сообществ гнойных воспалительных образований человека и животных предполагают изоляцию тем или иным способом возможно большего числа штаммов из ассоциации, их подращивание с использованием питательных сред и таксономическое отнесение с помощью стандартных тестов.

Их недостатком является длительность процесса определения состава ассоциации (недели и месяцы), необходимость применения многочисленных селективных сред для выделения штаммов и тестирования (неуниверсальность).

Известен также способ определения количества отдельных микроорганизмов в микробном сообществе по количеству специфического вещества (маркера), присущего исключительно данному роду (виду) микроорганизмов.

Недостатком этого способа является то, что он применим лишь для микроорганизмов, имеющих маркер.

В предлагаемом способе определение родового (видового) состава микробной ассоциации производится без вынесения отдельных штаммов и их подращивания, а также независимо от наличия маркера. В качестве исходной информации используется химический состав суммарной биомассы, определенный методом хромато-масс-спектрометрии или хроматографии с другими видами детектирования и химический состав (профиль) отдельных микроорганизмов, вероятных членов сообщества. Он определяется заранее и составляет банк данных, с помощью которого по разработанному математическому методу из состава суммарной биомассы выделяются профильные и маркерные признаки отдельных таксонов и производится идентификация таксона. При использовании полученных ранее калибровочных данных по количественному составу химических компонентов в микробной клетке производится определение каждого отдельного таксона (рода или вида) в сообществе.

Способ осуществляют следующим образом. 100 200 мг биомассы высушивают и подвергают кислому метанолизу в 200 мкл сухого HCl в метаноле при 80^oC в течение 3 4 ч. К реакционной смеси добавляют 100 мкл гексана и после встряхивания отбирают гексановую фазу, содержащую метиловые эфиры жирных кислот и диметилацетали, производные клеточных жирных альдегидов. Полученный экстракт анализируют в виде метиловых эфиров на хроматографе или хромато-масс-спектрометре. Для получения более полной информации о составе гидроксилсодержащих компонентов гексановый экстракт высушивают, остаток силилируют и реакционную смесь вводят в хроматограф для анализа в виде метил-триметилсилиловых эфиров. По масс-спектрам или времени и индексам удерживания идентифицируют компоненты пробы жирные кислоты, альдегиды, оксикислоты и пр. и определяют их количественное содержание, пользуясь методом внутреннего стандарта. Полученный состав представляют в цифровом виде и вводят в компьютер для расчета. В основе его алгоритма лежит закономерность и повторяемость химического состава определенного вида микроорганизмов и аддитивность профилей отдельных микроорганизмов в их суммарной биомассе. Для расчета количества клеток каждого микроорганизма используют систему линейных уравнений вида
A_i A_0j N_j k_ij k,
где A_i количество i-го вещества в экстракте жирных кислот и альдегидов; N_j количество клеток микроба данного сорта (j); k_ij переменный коэффициент, учитывающий особенности состава и свойства отдельных микроорганизмов, A₀ постоянный коэффициент, учитывающий условия проведения анализа. Эти величины входят в банк данных для конкретного сообщества микроорганизмов. В результате решения системы уравнений получают набор величин N_j ≠ 0, который по значениям индекса j определяет качественный состав данного сообщества микроорганизмов, а абсолютная величина N_j количество организмов j-го вида.

Определение видового состава микробных ассоциаций с использованием полного профиля химических компонентов суммарной биомассы и отдельных, входящих в нее видов, при условии выполнения материального баланса по каждому химическому компоненту ассоциации, ранее не производилось, что свидетельствует о соответствии предлагаемого способа критерию изобретения "новизна".

Способ может быть реализован на серийных хроматографах или хромато-масс-спектрометрах при использовании стандартных реактивов для подготовки проб и общеупотребимых персональных компьютеров для проведения расчетов, что свидетельствует о соответствии критерию изобретения "промышленная применимость".

На чертеже представлена хроматограмма по полному току (А) и масс-хроматограмма по ионам m/z 37 (ЖК) (Б) и m/z 175 (окси-ЖК) (В) суммарной биомассы накопительной культуры СВБ из нефтяной скважины (номера пиков соответствуют номерам веществ табл. 1).

Пример 1. Определение состава микроорганизмов накопительной культуры сульфат-восстанавливающих бактерий (СВБ) из Мыхпайской нефтяной скважины N 6070.

Для анализа взяли 30 мг биомассы вместе с твердым субстратом и сульфидом железа. Пробу высушили и добавили 200 мкл сухого HCl в метаноле. Смесь выдерживали 4 ч при 80^oC, затем полученные метанолизаты экстрагировали дважды, приливая по 100 мкл гексана и встряхивая. Гексановые экстракты объединили, высушили и обработали 20 мкл бис-(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 65^oC. Реакционную смесь, содержащую метил-триметилсилильные (МЕ-ТМС) производные жирных кислот, анализировали методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Полученные данные обработали по методу масс-хроматографии для выявления оксикислот по иону с m 175 и разветвленных жирных кислот по иону m 87. Полученные хроматограммы приведены для примера на чертеже. Идентификацию компонентов смеси проводили по их масс-спектрам, а их концентрацию определяли с помощью интегратора по площадям хроматографических пиков с использованием в качестве внутреннего стандарта 12-оксистеариновой кислоты. Полученный состав приведен в табл. 1. Номера пиков на хроматограммах чертежа и вещества в табл. 1 соответствуют друг другу. В табл. 1 использовано общепринятое обозначение жирных кислот. Индекс OH означает оксикислоту, цифра перед ним положение гидроксила, индексы "и", "а" соответственно изо- и антеизо-разветвленные кислоты, числа, разделенные двоеточием, означают число атомов углерода в цепи жирной кислоты и число двойных связей, а знак 9 положение двойной связи.

При первичном анализе сообщества данного типа рассмотрение качественного и количественного состава жирно-кислотной фракции в сопоставлении с известными профилями жирных кислот СВБ и сопутствующих им микроорганизмов позволило методом исключения (по отсутствию маркерных веществ) ограничить число возможных членов сообщества четырнадцатью представителями родов Desulfevibrie, Desulfebacter, pseudomonas, Thiobacillus, Bacteroides, Cytophaga, Flexybacter.

Для окончательного расчета составили 24 уравнения баланса по отдельным компонентам суммарной биомассы. В результате решения системы определили восемь родов и видов микроорганизмов, присутствующих в данном сообществе (см. табл. 2)
Примеры 2 7 (см. табл. 3). Расчет родового (видового) состава микроорганизмов метановых реакторов, работающих на стоках различных производств и искусственных средах.

Пробы биомассы обрабатывали и анализировали аналогично примеру 1. Дополнительно реконструирована масс-хроматограмма по иону m 75, характерному для метилацеталей, а также снята хроматограмма фракции фитанилглицеридов для определения метанообразующих архебактерий. Для проведения анализа и расчета использовали сведения по 43 микроорганизмам, характерным для метаногенного сообщества и 78 веществам из их состава.

Пример 8. Расчет родового (видового) состава микроорганизмов ассоциации гранул из метанового реактора бумажной фабрики (образец, состав которого приведен в колонке 1 табл. 3).

Проба биомассы обработана аналогично примеру 1. Но анализ жирных кислот и альдегидов проведен на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Идентификация компонентов хроматограммы проведена по относительным временам удерживания с использованием полученной ранее с помощью ГХ-МС метода картины расположения веществ на хроматограмме для данного типа сообществ микроорганизмов. Расчет состава сообщества проведен по схеме примеров 2 8 с использованием банка данных для метаногенного сообщества. Результаты приведены в табл. 4.

Преимущество способа заключается в том, что по сравнению с прототипом он универсален: можно определять состав любых ассоциаций микроорганизмов независимо от наличия маркерных веществ у ее членов. При этом способ отличается экспрессностью два дня на цикл анализа вместо недель при микробиологическом исследовании и не требует для анализа биологических материалов селективных сред, сывороток, антибиотиков и т. п. Чувствительность составляет 10⁴ клеток (10² клеток при предварительном концентрировании пробы).

Использование: биотехнология, экология сообществ микроорганизмов. Сущность изобретения: предлагается способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов путем хромато-масс-спектрометрического или хроматографического анализа биомассы на содержание компонентов микробных клеток: жирных кислот, оксикислот, альдегидов и т. д., причем сначала определяют состав тех же веществ для каждого вероятного члена ассоциации микроорганизмов, а затем определяют наличие и количество отдельных членов сообщества микроорганизмов. Способ применим при анализе микробных ассоциаций экологических ниш, эффективен при исследовании сообществ воспалительных образований человека. Чувствительность способа составляет 10⁴ клеток. 1 ил., 4 табл.

Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов, включающий хромато-масс-спектрометрический или хроматографический анализ суммарной биомассы на содержание жирных кислот, оксикислот, альдегидов и других химических компонентов микробных клеток, отличающийся тем, что определяют количество всех указанных веществ суммарной биомассы, определяют состав тех же веществ для каждого отдельного вероятного члена ассоциации микроорганизмов, а наличие и количество отдельных микроорганизмов членов сообщества определяют из условий равенства количества каждого химического компонента суммарной биомассы сумме вкладов в него отдельных микроорганизмов сообщества, имеющих этот компонент в своем составе.