СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНАЭРОБНОЙ ГАЗОВОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано для клинической диагностики газовой гангрены.

Для диагностики газовой гангрены применяются бактериологические, гистологические, иммунные, биологические методы, основанные на высевании микроорганизмов на селективные среды из проб биологических жидкостей человека и их диффренциацию по особенностям ферментации субстратов, на особенностях организации клеточной стенки и ее морфологии, на иммунных реакциях бактериальных токсинов и других специфических макромолекул. Известны также хроматографические методы, основанные на специфичности профиля продуктов метаболизма клостридий или изменении состава питательной среды после их культивирования.

Недостатки известных способов состоят в том, что одни из них длительны и трудоемки, например микробиологические способы, другие связаны с применением биологических материалов (сыворотки, ферменты, питательные среды, животные), которые требуют стандартизации и постоянного контроля, что снижает эффективность их использования.

Наиболее близким к предлагаемому является способ газохроматографической диагностики анаэробной газовой инфекции (АГИ) по продуктам метаболизма клостридий, который состоит в том, что эфирные экстракты центрифугатов культуральных сред клостридий, в том числе выделенные от больных АГИ, анализируют методом газовой хроматографии и по профилю метаболитов проводят хемодифференциацию двенадцати видов клостридий, разделенных на семь групп. При этом реперными веществами в профиле основного возбудителя газовой гангрены Clostridium perfringens является уксусная, масляная и пропионовая кислоты.

Недостатком этого метода является необходимость выделения чистой культуры от больных и низкая специфичность диагностических признаков. Известно, что уксусная, пропионовая и масляная кислоты производятся многими анаэробными бактериями и на фоне смешанной анаэробной микрофлоры не позволяют однозначно судить о наличии клостридий и, следовательно, диагностировать газовую гангрену.

Целью изобретения является повышение специфичности диагностики.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе диагностики газовой гангрены, включающем экстракцию продуктов метаболизма клостридий из ткани больных людей, их хроматографический анализ и диагностику газовой гангрены по наличию маркерных веществ, из гомогенизата ткани в очаге поражения экстрагируют высшие жирные кислоты и по наличию в их составе 10-оксистеариновой кислоты или 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот совместно судят о заболевании газовой гангреной, при этом концентрацию маркерных 10-оксикислот определяют как отношение площади их хроматографического пика к площади пика гептадекановой кислоты.

Способ основан на том, что при взаимодействии клостридий с клетками организма хозяина происходит ферментативное окисление основных ненасыщенных жирных кислот с образованием 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой, а иногда 10-оксипальмитиновой кислот. Эти кислоты отсутствуют в составе самих клостридий и клетках организма хозяина и поэтому могут служить хорошими маркерами газовой гангрены.

Способ является новым, так как ранее не использовали 10-оксикислоты для диагностики газовой гангрены. Способ обладает положительным эффектом, так как маркерные летучие кислоты прототипа: уксусная, масляная и пропионовая не являются строго специфичными и образуются также при неклостридиальной инфекции, а 10-оксикислоты появляются только в присутствии клостридий и (или) при наличии клинических признаков газовой гангрены.

Способ осуществляется следующим образом. Материал из очага поражения (ткань, экссудат) тщательно гомогенизируют и производят экстракцию из него высших жирных кислот (ВЖК) одним из известных способов. В процессе экстракции или после нее ВЖК переводят в летучие производные - метиловые или триметилсилиловые эфиры. Пробу полученных эфиров анализируют методом газовой хроматографии или хроматомасс-спектрометрии. Наличие в составе экстракта 10-оксистеариновой или совместно 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот свидетельствует о заболевании газовой гангреной. 10-оксикислоты С18: 0 и С18:1 (18-число атомов углерода, 0 и 1 - число двойных связей) образуются преимущественно при инфицировании клостридиями вида перфрингенс, а также видами эдематиенс (нови), гистолитикум и септикум. Эти кислоты не обнаруживаются в клетках самих клостридий, а также в клетках других микроорганизмов. Известно, что оксикислоты с другим расположением гидроксила - в положении 2 и 3 - присутствуют лишь в составе липида А полисахаридного антигена грамотрицательных бактерий.

10-оксикислоты ранее были обнаружены лишь в трупных тканях и для клинической диагностики не использовались.

П р и м е р 1. К 1 г материала ткани больного добавляли 2 мл изотонического раствора хлористого натрия (0,66%), материал тщательно гомогенизировали, добавляли 2,5 н. соляную кислоту в соотношении 10:1 с материалом и проводили гидролиз в термостате при 60^оС в течение 6 ч. После этого материал охлаждали и проводили экстракцию гексаном два раза по 1 мл. Экстракт упаривали и обрабатывали 15 мин при 65^оС с 20 мкл БСТФА (бистриметилсилилтрифторацетамида) для получения триметилсилиловых эфиров. Реакционную смесь в количестве 1-5 мкл вводили в инжектор хроматографа с капиллярной колонкой. Заболевание газовой гангреной определяли по наличию 10-оксистеариновой кислоты. Ее количественную характеристику получали отнесением площади хроматографического пика этой кислоты к площади пика гептадекановой кислоты. Результаты по примеру 1 в сопоставлении с клиническими и бактериологическими данными обследования больных приведены в табл. 1, NN 1-4 и 6-12.

П р и м е р 2. Водную фазу гомогенизата после экстракции гексаном по примеру 1 депротеинизировали 30%-ной сульфосалициловой кислотой, центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, супернатант выпаривали, а сухой остаток экстрагировали метанолом 2 раза по 1 мл. Объединенный экстракт упаривали, обрабатывали БСТФА, анализировали как в примере 1 и определяли наличие 10-оксикислот С18 и их количественные показатели. Результаты по примеру 2 приведены в табл.1, N 5.

В таблице приведены данные, которые показывают, что во всех случаях обследования больных, у которых по клиническим данным зафиксировано заболевание газовой гангреной, диагноз подтверждается анализом 10-оксикислот, а при отсутствии такового эти кислоты не обнаруживаются, т.е. предлагаемый способ не дает ложноположительных или ложноотрицательных определений. Опыт 5 не является ложноположительным, так как бактериологический анализ дает наличие клостридий и предлагаемый способ фиксирует это, хотя клиническая картина газовой гангрены еще не проявляется. Это свидетельствует о высокой чувствительности предлагаемого способа.

Данные табл.1 по бактериологическим исследованиям свидетельствуют также о специфичности способа в отношении клостридий. 10-оксикислоты обнаруживаются в тканях больных только при наличии клостридий. Присутствие других бактерий: кокков, псевдомонад, энтеробактерий, а также анаэробной неклостридиальной микрофлоры не вызывает образования 10-оксикислот С18:0 и С18:1, т. е. не дает перекрестных ложных определений газовой гангрены. В здоровых тканях 10-оксикислоты отсутствуют - опыт 10 (см. табл.1).

П р и м е р 3. 0,5 г материала ткани морских свинок, инфицированных клостридиями видов перфрингенс, эдематиенс, септикум и гистолитикум, гомогенизировали, высушивали и обрабатывали 2,5 г. HCl в сухом метаноле для экстракции жирных кислот и одновременного образования их метиловых эфиров. Обработку проводили в течение 4 ч при 80^оС. Из метанолизатов экстрагировали метиловые эфиры жирных кислот смесью гексана и хлористого метилена в соотношении 2: 1. Для анализа 5-10 мкл экстракта вводили в хроматограф. Анализ проводили на капиллярной колонке с метилсиликоновой фазой типа 0-1 при программировании температуры со скоростью 5-8 град/мин в интервале температур 100-300^оС. Одновременно сухие пробы метиловых эфиров жирных кислот силилировали как в примере 1 и анализировали оксикислоты С18 методом масс-фрагментографии на хроматомасс-спектрометре для определения малых концентраций этих кислот, присущих опытам на животных. Заболевание определяли при хроматографическом анализе по наличию пиков 10-оксистеариновой и 10-оксиоктадеценовой кислот на хроматограмме, получаемой с помощью плазменно-ионизационного детектора, а при масс-фрагментографии - по наличию ионов, специфичных для метилтриметилилильных производных 10-оксикислот С18 при соответствующих им временам хроматографического удерживания. Одновременно проводили селективное детектирование гептадекановой кислоты по молекулярному иону ее метилового эфира и определение количественных характеристик содержания оксикислот. Результаты опытов с двумя сериями инфицированных и контрольных животных приведены в табл.2.

Из данных табл. 2 следует, во-первых, что оксикислоты обнаруживаются достаточно надежно, так как их количество соизмеримо или больше количества гептадекановой кислоты, а она всегда хорошо видна на хроматограмме тканевых жирных кислот. Во-вторых, маркер интенсивен по величине, поскольку она превышает минимально детектируемое значение по 10-оксистеариновой кислоте в 5-300 раз.

П р и м е р 4. (по известному способу). 1 г материала от больных с анаэробной инфекцией гомогенизировали, добавляли 1 мл физиологического раствора, центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. рН супернатанта доводили 50% -ной серной кислотой до 2,0. Проводили экстракцию эфиром два раза по 1 мл. Полученный экстракт в количестве 2-5 мкл вводили в хроматограф и определяли количество масляной и пропионовой кислот в качестве теста на присутствие летучих кислых метаболитов клостридий (по прототипу). Из 36 обследованных больных у пяти клинически и бактериологически определена газовая гангрена. Для них получено соотношение пропионовой кислоты к масляной, равное 3:10, а для больных с неклостридиальной формой анаэробной инфекции - 4:10. Как видно, специфичность этого признака невелика. Если разница и выходит за пределы погрешности измерений, но при единичном анализе такая диагностика ненадежна (неспецифична) и может быть использована лишь как дополнительный признак в суммарной клинической диагностике или для подтверждения бактериологического анализа после подращивания выделенной культуры клостридий и анализа кислых метаболитов среды, в которой оно производилось.

Данные анализа по прототипу, приведенные в табл.1 и примере 4, показывают, что этот способ не дает однозначного диагноза. Признаки газовой гангрены по прототипу - уксусная, масляная и пропионовая кислоты, присутствуют и при других видах анаэробной инфекции. Это означает, что известный способ может быть использован как предварительный тест на возможное наличие клостридий, а для окончательного диагноза необходимо подтверждение другими данными. Заявляемый способ специфичен для клостридий и не дает перекрестных определений с другими видами возбудителей, присутствующих в раневой инфекции.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществлять специфическую диагностику газовой гангрены на фоне неклостридиальной аэробной и анаэробной микрофлоры. Кроме того, в отличие от известных способов диагностики, хроматографический способ определения анаэробной газовой инфекции не требует для выполнения специфического биологического тестового материала: ферментов, сывороток, питательных сред, экспериментальных животных и т.п. Аппаратура и используемые реактивы универсальны, т.е. общеупотребимы в хроматографическом анализе.

Использование: в медицине, в методах клинической диагностики. Цель: повышение точности и специфичности способа. Сущность изобретения: у больного берут пробу ткани из очага поражения, готовят гомогенат ткани, в котором методом хроматографического анализа определяют высшие жирные кислоты и по наличию 10-оксистеариновой или одновременно 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот диагностируют газовую гангрену. 2 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНАЭРОБНОЙ ГАЗОВОЙ ИНФЕКЦИИ, включающий хроматографический анализ экстрактов культуральных сред клостридий, выделенных из тканей больных, отличающийся тем, что , с целью повышения точности и специфичности способа, берут ткань из очага поражения, готовят гомогенат ткани, в котором определяют высшие жирные кислоты, и по наличию 10-оксистеариновой или одновременно 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот диагностируют газовую гангрену.