(46) 07.01.91. Бюл. №
(21)4257713/14
(22)05.06.87
(71)Институт клинической психиатрии Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР
(72)Ю.Б. Юров, И.А. Александров, С.П. Миткевич и С.Г. Ворсанова
(53)612.015(088.8)
(56)Генетика, 1984, т. 20, № М, с. 1749-1762.
(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА Х-ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА
(57)Изобретение относится к медицинской генетике и может быть использовано для определения числа Х-хромосом Б ранней пренатальной диагностике на материале биопсии хорина в первом триместре беременности и постнатальной диагностике ; на материале некультивируемых клеток периферической крови человека нас- ледственньи болезней, сцепленных с полом и связанных с численными
нарушениями в системе Х-хромосом (синдромы Клпйнфельтера, Тернера, трипло-Х). Цоль - ускорение и повышение точности способа. Сущность изобретения заключается в том, что клонированньп фрагмент альфа-сател- литной ДИК человека используется в качестве ДНК-зонда для выявления Х-хромосом в интерфазньтх ядрах, позволяя в течение 2-3 дней определить число Х-хромосом На цитологических препаратах клеток человека при проведении гибридизации в следующих условиях: температура гибридизации 42 С, продолжительность гибридизации 18 ч, состав раствора для гибридизации 50% формамида, 10% декстрансульфата 500; 0,15 М хлористого натрия; 0,015 М цитрата Натрия и радиоактивной ДНК-зонда в концентрации 0,5«10 импульсов в 1 мин в расчете на 20 мкл гибри- дизационной смеси.
§
сл
с
Изобретение относится к медицинской генетике, в частности к области медико-генетического консультирова-, НИН и пренатальной диагностики наследственных болезней, сцепленных с полом, и связанных с численными нарушениями в системе половых Х-хромосом, и может быть использовано для ; ранней экспресс-диагностики на материале биопсии хориона человека в первом триместре беременности или на материале периферической крови человека без культивиропяния клеток.
Цель изобретения - ускорение и повьппение точности способа.
Сущность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент альфа-сателлитной ДНК человека, специфически маркирующий Х-хромосому используется в качестве ДНК-зонда дифференциального выявления Х-хромог сом в интерфазных ядрах или метафаз-, ,ных клетках человека, позволяя быст- PQ и надежно определять число Х-хромосом на цитологических препаратах клеток человека в условиях in situ.
vj
N
Источником вьщелепня маркерного фрагмента альфа-сателлнтиой ДИК (проба pYAM 10/АОА) служит тотальная ДНК человека, выделенная стандартным 5 методом из ffneTOK плаценты. Препарат ДНК человека обрабатывают рестрикта- зой Pst I до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты вшивают с помоп;ью -лигирования в сайт Ю Pst 1 плазмидного вектора pUC19 (размером 2688 пар нуклеотидов). Полученной после лигирования смесью, содержащей встроенные в плазмиду фрагменты
молекул ЛИК н условиях in situ.npOBo дят как описано в примере I.
Пример 1. Тотальную ДНК человека выделяли из клеток плаценты, Размельченную механически ткянь помещали в 2-3-крлтный объем 0,05 М буфера трис-НС1,р1| 9,0 и размел1,ча- ли до получения клеточной суспензии ,в гомогенизлторе в течение 10 с, К суспензии клеток добавляли лизи- рующий раствор додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1%.
1 О мин
Раствор прогревали в течение о.
геномной ДНК человека, трансформируют 5 при 60 С, а затем пронодили фе1голь- бактериальные клетки E.coli штамм ВМН 71/17. Бактериальные клетки после трансформации высевают на селективную среду Мак-Конки (фирма Дифко) для
ную и хлороформную депротеинизяц1по. ДНК из раствора (йодной фазы) осаждают равным объемом пзопропилового
спирта в течение
ч при - 18 С.
выращивания бактерий, позволяющей Осадок рагтпоряют в буфере ТЕ (50 мМ
бирать трансформированные клетки, содержащие плазмидную ДНК со вставкой ДНК человека. Это обусловлено тем что плазмид а pUC19 содержит сайт Pst I в гена синтеза /3-галактози- дазы, который инактивируется в результате встройки любого фрагмента ДНК в этот сайт.
Таким образом, на селективной среде бактериальные колонии, содержащие плазмиды со вставкой ДНК человека, окрашиваютс я в белый 1гвет, а колонии без рекомбинантных плазмид - в красный. Следовательно, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку и отобрать клоны бактериальных клеток, содержащих встроенные в них фрагменты ДНК человека.
Для отбора бактериальных клонов, содержащих плазмиды с альфа-сател- литной ДНК человека, проводят гибридизацию КОЛ01ГИЙ на нитроцеллюлозных фильтрах с меченной З р-дцк альфоид- ной ДНК человека размерюм пар нуклеотидов,который клонирован, сек- венирован и отнесен к альфл-сятеллит- ной ДНК. Колонии, которые дают положительный сигнал На радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосом- ной локализации клонированных рест- риктных фрагментов ДНК непосредственно в цитологических препаратах хромосом .
Получение .цитологических преиггря тов интерфазиых и метафазных. клеток, меченных трш ием образцов ДНК, и , гибрндизппи моченных ралиоактшии,- ми предшггл 1и чмиклми рекомбип.чнт.чых
ZA
молекул ЛИК н условиях in situ.npOBo- дят как описано в примере I.
Пример 1. Тотальную ДНК че ловека выделяли из клеток плаценты, Размельченную механически ткянь помещали в 2-3-крлтный объем 0,05 М буфера трис-НС1,р1| 9,0 и размел1,ча- ли до получения клеточной суспензии ,в гомогенизлторе в течение 10 с, К суспензии клеток добавляли лизи- рующий раствор додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1%.
1 О мин
Раствор прогревали в течение о.
при 60 С, а затем пронодили фе1голь-
при 60 С, а затем пронодили фе1голь-
ную и хлороформную депротеинизяц1по. ДНК из раствора (йодной фазы) осаждают равным объемом пзопропилового
при 60 С, а затем пронодили фе1голь
спирта в течение
ч при - 18 С.
5
0
5
0
0
5
5
трис-HCl, рН 8, 0,5 мМ ЭДТА), содержащем 1%-ный раствор додецилсульфата нл.трия (SDS) Для удаления остаточных белков препарат обрабатывают протеипазой К (100 мкг/мл) в течение 2 ч при 37 С, а затем повторно проводят фенольную и хлороформную зкстракцию, как опислно выше. Препарат ДНК ослждают равным объемом изо- пропилового спирта, высушивают, растворяют в буфере ТЕ в концентрации от 1 до 5 мг/мл. Для удаления из препарата РНК, раствор шкубируют в течение 2 ч при 37°С с РНКазой в концентрации 100 мг/мл. Затем проводят фенольную и хлороформную депро- теинизацию, осаждение ДНК изопропи- ловым спиртом, как описано выше.ДНК растворяют в буфере ТЕ и определяют концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра при волне 260 нм.
ДНК рекомбинаитпых плазмид для получения геномной клотютеки и для , скриннинга бактериалыи.гх колоний пы- . деляют из 100 мл ночной культуры, выращивая бактерии на среде LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl с добавлением ампициллина до концентращ1и 100 мг/мл). Бактериальные клетки из водной фазы осаждают 2,5 объемами этилового спирта. Образцы ДНК растворяют в буфере ТЕ и используют для лш ирова- ния и получения геномной кдонотеки как описано ниже.
Компетентную культуру бактерий гатамма ВМН 71/17 готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB вносят I мл ночной культуры E.coli
и вырлтиолют н;з качалке до мутности Aj5P 0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до раствора 100 мМ СаС,клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл 100 мМ CaCl. Клеточную суспензию вьщерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М 15% глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0 С в течение 30 мин, культура готова к трансформации. Культуру хранят при -80°С.
К 200 мкл компетентной культуры бактерий при д бaвляют 0,1- 0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой же температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню с температурой на 60-90 с и снова помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют до I,5-2 мл жидкую питательную среду LB и подращивают на к чаллсе 2 ч при . Трансформированные клетки высеивают на селективную среду Мак-Конки (по 0,1 мл культуры на чашку Петри со средой в 1,5% агаре) с добавлением ампициллина.
Для идентификации колоний бактерий, содержащих плазмиды со вставками ДНК человека, и окрашенных в белый цвет, их наносят р епликой на нитроцеллюлозные фильтры, находящиеся на поверхности чашек Петри с твердой питательной средой LB. Выросшие в течение суток при 37°С бактерии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 Н NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив, осаждали из 100 мл ночной культуры в течение 10 мин при 6000 об/мин центрифугированием.Осажденные клетки ресуспендировали в 10 мл буфера, содержащего 50 мМ глюкозы, 25 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-НС1 рН 8,0 и 2 мг/мл лизоцима.-После 15-минутной инкубации при комнатной температуре добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора 0,2 Н NaOH и lZ-ный додецилсульфат натрия. После тщательного перемешивания и 5 мин инкубации при О с добавляют 15 мл раствора 3 М ацетата натрия, рН 4,8, тщательно перемешивают и
49A7246
вьщрржипяют 1 ч при . ОС.1ЛПК получают нентрифугировянием i течение 20 мин при 14000 об/мин (ротор Бекман 2-2 I ) .. Нлдосадочную жидкость, содержащую плазмидную ДИК, смешивают с равным объемом хлороформ- изоамилопого спирта (смесь в соотношении 24:1), энерг ично встряхивяют и
10 центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об/мин (ротор Бекман М-7,5). Отбирлют водную фазу и плпчмидиую ДНК осаждают ровным объемом изоамл- лового спирта в течение I ч при
15 -18 С. Ссадо; собирают центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/ /мин (ротор Некмлн М-7,5) и растворяют в воде. Затем Д}1К персосяждают из водного раствора 2,5 объемами
20 этилового спирта п течение I ч при -18 С. Осадок собирают центрифугированием, промывают дважды 70%-ным этиловым спиртом, высушипают и растворяют в 200 мкл буфера ТЕ.
Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальной плазм щы pUC19 проводят п буфере, содержащем 10 мМ трис-ИС, рН 8,0 10 мМ N.-iCl,
О мМ MgCl 7 11 1 М дипкп рейтола. Время полного гидролиза рестпикта- зой Pst 1 в конпеитрлции 5 ед/мкг ДНК составляет 4 ч в случае плазмид- ной ДНК и 18 ч в случле ДНК человека.
Реакция останавливается добавлением равного объема фенола. После феноль- ной и хлороформной депротеинизааи н водная фаза трижды промывается водо- насыщенным эфиром, и ДНК фильтр с
нижней стороны фильтровальной бумагой, дважды по 10 мин его обрабатьшают раствором 1 М трис-ПС1, рН 8,0{ затем 1,5 М раствором NaCl с 1 М трис- НС1, рН 8,0 в течение 10 мин. Высушенный фильтр помещают Б раствор 2SSC с протеиназой К в концентрации 50-100 мкг/мл и инкубируют в нем при 37°С в течение I часа. Далее фильтр промывают в 0,3 К NaCl, а затем высушивают под вакуумом 80 С в течение , 2 ч.
Образцы ZIHK для гибридизации на фильтрах с колониями или на хромосо- мах in situ метят изотопной меткой
методом замещения: в 190 мкл воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буфера (0,8 М трис- НС1, рН 7,4,- 0,1 М MgClj, 0,05 М дитиотрейтола), 5 мкл нерадиоактив11ЫХ ле;шксинуклеояидтрифасфлтои (по О,( 2 М клжлого) , 5 мкл Д К;13Ы (концентрация I мкг/мл), 5 мкл ДНК- полнмеразы 1 (коицентраиил 0,5- 2 ед/мкл) , 1 О мкл меченного тритием (для гибридизации in situ) или фосфором (гибридизация колоний) одного из дезоксинуклеоэидтрифосфата и во-1 ды до конечного ббъема 150 мкл. Ре- aKiuno ведут в течение мин при . Средняя удельная радиоактивность состапляет около 2, импульсов в I мин в расчете на 1 мкм ДИК в случае трития и около 2,5 «10 им- пульсов в 1 мин в случае фосфора
(ГР).
Перед гибридизацией фильтр с колониями бактерий вымачивают при 67 С в растворе 6xSSC; 0,5% SDS; 0,1% фиколл-400 и 0,1% полифенилпирроли- дои в течение 60-90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 5 мл гиб ридизациоиной смеси, содержащей , 0,1% SDS, 10% декстраисульфа- та-500, 50 мкг/мл поли-А и денатурированную Р-гфобу с суммарной активностью l-5 IO имп/мин. Гибридизацию проводят при 67 С в течение 18ч, Фильтры промьшают в нескольких сменах 2 SSC с 0,1% SDS при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем при 42°С в 0, и 0,1% SDS в течение 15 мин. Фильтры высушивают и помещают а кассету с рентгеновской пленкай РМ-1. Через 24 ч экспозиции пленку ироннлягот и радиоаптографи- чески идентифицирую т гибридные клоны по наличию положительных сигналов (засвечивание фотоэмульсии при контакте с участками г ибридизации ченной даю.
Предлагаемым способом ставят опыт с клонотекой из раэл1тчных фрагментов Pst I ДИК человека. При этом в качестве зонда дли гибридизации на колониях берется проба альфоидной ДИК человека, препаративно пыделенная ий состава клонированного RcoR 1-фраг7 .мента альфоидноГ ДИК СЮров, Яконлев, Зайцев и др. 1986). В указанный образец альфоидной ДИК вводится изотопная метка предлагаемым методом замещения. После гибридизации нп коло- ниях особенно четко обн,тру;кипается сигнал на иес-.колысих колониях, одил из которых полумила iiatuiaHue р YAM I 0/40А, с.оотпетстненно ее порядковс;-му номеру и исходной клонотеке. Ре- комбинатг(ая плазмида р YAM I 0/40А для специфического маркирования хро- мосомы X человека состоит из фрагмента Pst I векторной плаэмиды размером 2,7 тыс.п.н. и фрагмента PstI хромосомной ДИК человека размером 2,0 тыс.и.н.
Препараты хромосом для гибридиза- 1Д1И in situ готовят из культивируемых лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитагемагглютинина (фирма , США). Культивирование проводят в пе- нициллиновьгх флаконах в среде Игла с добавлением до 10% сьшоротки крупног рогатого скота в течение 72 ч.Затем добавляют колхицин до конечной кон-i центрации 0,20 мкг/мл. Клетки в сре- - де культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендпруют в гипотоническом растворе 0,075 М КС1 и инкубируюТ: в течение 15 мин при 37°С. Фиксацию клеток проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Клетки раскапьшаготся На предметные стекла и высушивают на воздухе.
Гибридизацию in situ меченной Радиоактивными предшественниками реком бинантной р YAM 10/40А проводят с предварительной денатурацией метафаз ных и интерфазных хромосом в течение 30 с в 0,07 Н NaOH с последующим промьшанием препаратов по 5 мин в 70 и 96%-iioM этаноле. Препараты радиоактивно меченных рекомбинантных плазмид денатурируют нагреванием при в течение 10 мин в гибридиза- циониой смеси, содержащей 50% фор- мамида, 2 SSC, 10% декстрансульфата- 500 и до 1-2 10 имп/мин. радиоактивной ДИК. Гибридизацию проводят при 42°С в течение 18ч. Препараты после гибридизации промывают в А сменах 2 SSC при по 5 мин в каждой смене, затем в 70 и 96%-ном спирте по 5 мин и высушивают на воздухе. Препараты покрьшают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте -3 дня. После проявления стандарт- ньп-1 фотопроявителем препараты окра- 1иивают красителем Гимза. Радиоавтографы хромосом анализируют и фото- графирук т при Увеличении микроскопа
50
Г ибридизлиия in situ ил мет,ч(1)аз11ь хромосомах покязынпрт, П о к. ияшро- ваиный фрагмент р YAM 10/40Л локалмзуется только в прицентромерном рай- one хромосомы X и сттецифнчески маркирует данную хромосому.
Пример 2. Применение реком- бииантнон плазм:щы р YAM 10/40А для определения числа хромосом X в мета- фазных и интерфазных клетках индивидов мужского пола (кариотип А6, XY) . женского пола с нормальным кариоти- пом (А6, XX) индивида с мозаичным кариотипом 45,Х/46,Х изоХ (мозаичный случай синдрома Тернера), индивида с кариотипом 49, XXXXY (синдром Клайнфельтера) было проведено на препаратах Л1гмфои.итов, как описано в примере 1. Все процедуры по гибридизации in situ, включая введение метки в плазмиду р YAM 10/40А, денатурацию ДИК, условия гибридизации и анализа препаратов, повторяются аналогично примеру 1. Отличия состоят лишь в том, что в этом примере используются клетки индивидов с разным содержанием хромосом X.
С помощью ДИК р YAM 10/40А в клетках мужчины, содержащих одну хромо- сому X, выявляется одно крупное скопление изотопной метки, соответствующей единственной хромосоме X как в м тафазных, так и интерфазных хромосомах. В клетках женп(ин, содержащих две хромосомы X, выявляются Два скопления метки, соответствуюи их двум женским хромосомам X. Анализ мета- фазных и иитерфазных клеток индивида с мозаичным кариотипом 45, Х/46, X изоХ значительно облегчается при использовании маркерной плазмиды Р YAM 10/40А. При этом удается без применения методов дифференциального окрашивания хромосом по длнне и де- тального кариотипирования большого числа метафазиых пластинок, выявить клетки с одной и клетки с двумя хромосомами X. Впервые создается возможность надежно определить число хромосом X в интерфазных клетках и определить долю клеток с разным числом хромосом X при мозаицизме. Это особенно важно для анализа образцов дифференцированных клеток разных тканей, которые ме способны к делению,и, следовательно, провести ст ан- дартный анализ хромосом с помощью различных методом окраш1 вания не
5
O 5 0
5 0 5 0 5
предстлрляетгя возможным. Анализ ин- терфачных клеток индивида с кяриоти- пом 49, XXXXY однозначно показывает наличие в большинстве клеток 4 скоплений метки соответствуютих хромосомам X. Следовательно, плазмида для маркирования хромосомы X позволяет надежно проводить диагностику различных вариантов полисомий по числу хро- мрсом X, п частности, часто встречающихся синдромов Шпрешевского - Тернера и Кляйнфельтера.
Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения маркерной плазмиды р YAM 10/40А для пре- натальиой диагностики пола или численных нарушений в системе хромосом X служит ныпг.лрнис хромосом X в клетках, цолученньух из материала биопсии харио- на плода п первом триместре беремен- ности.
В этом случае хромосомы X выявляют в неделящихся, нативных клетках вор- сииок хориона, полученных на 7-8 неделе беременности. Препараты интерфазных ядер готовят методом отпечат-, (ов, для чего плотно прижимают биоп- сийный материал к поверхности чистого сухого предметного стекла в нескольких местах, в результате чего отдельные клетки прикрепляются к стеклу. Клетки фиксируют в течение I5 мин п метанол-уксусном фиксаторе (3:1) и высушивают на воздухе. Процедура приготовления препаратов клеток хориона для последующей диагностики занимает при этом способе не более 30 мин. Альтернативный способ получения цитолопгческих препаратов заключается в суспендировании клеток хориона в гипотоническом растворе 0,075 М КС1 при комнатной температуре. После 15 мин воздействия гипотоническим раствором клетки фиксируют дважды метанол-уксусным фиксатором (3:1) и раскапывают на предметные стекла, как в примере I. Гибридизация in situ клеток хориона, с маркерной плазмидой проводится ,как в приме- ре 1 .Микроскопический анализ результатов гибридизации показывает наличие в клетках одной или двух хромосом X, что соответствует мужскому или женск.о- му кариотипу. В этом способе диагностики удается определить число хро- MQCOM в неделящихся клетках ворсинок хориона в течение 2-3 дней. Альтернативные методы диаг ностики пола при
проведении пренатальной диагностики занимают 2-4 недели при использова- нии методов хромосомного анализа в случаях культивирования клеток хори- диа или амнкстической жидкости.
Таким образом, клонированная пос- цедовательность ДКК р YAM 10/40А позволяет эффективно маркировать половую хромосому X человека, что создает возможность для молекулярио-цито- генетической диагностики пола D первом триместре беременности (8-10 недель) в сл чаях наследственных болезней, сцепленных с полом. Благодаря точности и быстроте метода правильный диагноз можно поставить п короткий срок. Кроме того, применяя этот способ, можно точно и быстро диагностировать наследстпенную патологию, спмзанп тс с численными нарушениями в системе половых хромосом, включая такие часто встречаемые типы хромосомной патологии, как синдромы Шерешевского - Тернера (различные формы), КлаЙнфельтера (различные формы), трипло-Х, и также сложные случаи мозаицизма по этим заболеваниям.
: Ограничения предлагаемого способа с использованием интерфазных ядер при проведении пренатальной диагностики связаны с анализом индивидои с кариотипами 46, XY (нормальны муж Ч1ша) и 45, X (синдром Тернера), а также 46, XX (нормальная женщнна) и 47, XXY (снндром Клайнфельтера) . В этих случаях при спещтальных показа
ниях необходимо проводить анализ ме- тафазных хромосом. Использование предлагаемого способа позволяет отказаться в случае анализа метафазных хромосом от методов дифференциального окрашивания, поскольку половые Х-хромосомы эффективно маркируются радиоактивной меткой. При проведении постнатального определения числа Х-хромосом, когда пол индивида уже известен, ограничений для применения метода нет.
Формула изобретения
0
5
Способ определения количества X-3tpoMocoM человека путем фиксации клеток пациента с последуюаош подсчетом Х-хроносом, отличающий с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, фиксируют интерфазные клетки, которые дополнительно обрабатьгоают 0,07 М едким натром п течение 30 с, затем к ним добавляют радиоактивный ДНК-зонд и инкубируют до 18 ч при 42 С в среде, содержащей солевой раствор 0,3 М хлористого натрия, 0,03 М цитрата натрия, 50% формами0 да, 10% декстрансульфата, далее от- мьшают в том же растворе при физиологической температуре в четырех сменах раствора по 5 мин, покрьшают препараты фотоэмульсией, проявляют
5 через 1-3 дня и подсчитьшают число маркированных радиоактивной меткой Х-хромосом в интерфазных ядрах клеток паш1ента.
