Рекомбинантная плазмидная ДНК альфа RI-7, предназначенная для маркирования 1-ой хромосомы человека Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/68 

ИНЖ B3HV МОЖ

тике сом пре ку : ане

Изобретение относится к генетической нерии, в частности к области конструиро- я молекулярно-геиетических маркеров, и JT быть использовано в медицинской гене- для достоверной идентификации хромо- 11 человека в норме и патологии, включая атал.ьную и постнатальную диагности- ромосомной патологии, диагностику плоидий при различных формах рака, а

таю се для цитогенетического картирования гене ма человека.

Известно, что к настоящему моменту кло- нир званы и охарактеризованы ДНК-зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК-зондов чаще всего испольуют уникальные (однокопийные или малокопий- ные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молеку- лярно-цитогенетическую диагностику из-за низ сой разрешающей способности совре-. мен -)ых цитогенетических методов.

Исключением являются хромосомо-спе- цифичные ДНК-зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сэтеллмтные (альфа- и классические сателлитные ДНК). На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК-зонды альфо- идной ДНК со спецификой для хромосом II и X человека (No1203t08 и №1494724).

Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК-зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических .са- теллитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружен малокопийный вариант альфо- идной ДНК человека, который имеется в хромосоме I (Willard et a.. 1989). Этот ДНК- зонд не позволяет эффективно маркировать хромосому 1 человека, т.к. гибридизуется

кроме хромосомы I с рядом другим хромосом - II, 17 и X.

Описан также вариант классической сателлитной ДНК человека, специфичный для района вторичной перетяжки (район 1gh) хромосомы I (Cook et al.. 1982), Этот район характерен для длинного плеча хромосомы I. Актуальным для молекулярно-ци- тогенетической диагностики остается конструирование маркера для центромер- ного района хромосомы I человека, .который позволил проводить маркирование и иденти- - фикацию центромерного района хромосомы I в интерфазных и метафазных клетках.

Изобретение не имеет аналогов, так как подобная рекомбинантная плазмида для высокоспецифичного маркирования центромерного района хромосомы I человека, разработана впервые. Полученная реком- бийа нтная плазмида альфа-Р1-7 отличается от известных по литературе клонированных сэтеллитных ДНК по способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосомы I человека. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогоа, т.к. для молекулярно-цитрге- нетического маркирования и идентификации центромерного района хромосомы I человека данное техническое решение разработано впервые..

Целью изобретения является создание нового молекулярно-генетического маркера 1-й хромосомы человека, специфичного для центромерного района, включая гетерохро- матин обоих плеч, применение которого позволяет проводить простым способом диагностику аномалий хромосомы I в медицинской генетике и онкогенетике.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент ДНК аль- фа-R 1-7 из лимфоцитов человека, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 1-й хромосомы человека. Данный фрагмент имеет длину 680 пар нуклеотидов и состоит из 4-х альфоидных мономеров (длиной 170 н.п, каждый), расположенных тандемно, т.о. nd типу 3 конец предыдущего мономера 5 концу последующего мономера.

Данная последовательность нуклеотидов относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК-зонда, опытов по блот- гибридизации и по гибридизации на хромосомах In situ.

Новый ДНК-зонд отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющего четыре внутренних уникальных сайта рестрикции BspR1 и ограниченного EcoRI-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот новый ДНК-зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях In situ, которые

0 включают хромосомы 5,7,19. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК-зонд гибридизует- ся только с центромерным районом хромосомы I человека.

5 Конкретная цель исследования достигз- лась следующим образом.

Источником выделения маркерного фрагмента альфа-Р1-7 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом элект0 рофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 Amlcon. Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидов мужского пола) обрабатывают рестриктазой EcoR1 до пол5 ного гидролиза. Полученные рестриктные . фрагменты вшивают с помощью лигирова- ния по липким концам в EcoR1-сайт бактериального плазмидного вектора pBR325 (4,3 т.п.н.). Данная плазмида несет ген ус0 тойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициплину в плазмиде позволяет на среде с.этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет

5 создать рекомбинантхую клонотеку (по типу short-gun) при автоматической селекции на среде с ампициллМном.

На следующем этапе в созданной кло- нотеке идентифицируют клоны, обладэю0 щие гомологией с чльфа-ДНК. Дли этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлоз- ных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором ( Р) ДНК; тотальной фракции ARI-ДНК чело5 „века, которая представлена, в основном, |льфоидной ДНК. Колонии, ДНК, которых Дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосом0 ной локализации клонированных в них ре- стриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят

5 из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулирование к делению с помощью фитогемагглютинина(фирма Дифко, США) лимфоциты крови культивируют в пеницил- линовых флаконах при 37°С в среде Игла с

добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 часов. За 1,5 часа до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл, Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCI и инкубируют 10 минут пр|и 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в отношении 3:1)триж- ды по 20 минут. Препараты хромосом хр анят при 37°С и используют в опытах не пёзднее 2-3;х недель после приготовления. Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой из- вестным методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последе вательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCI. рН 7,4; 0.1М MgCte; 0,05М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эк вимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого Зс исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация -1 мкг/мл), 10 м сл3Н-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль. концентрация 5 м (и/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 минут при 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25x10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченой радиоактивны- м/I предшественниками рекомбинатной f. ЯК альфа-Р -7 с метафазными хромосома- м 1 in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 секунд в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 минут в 70 и 96% спирте; препараты радиоактивных образцов-ДНК денатурируют в гидр йдиза- ц юнной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный соловой раствор (2 SSC), в течение 10 минут п эй 100°С в течение 17-18 часов. Препара- тп после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2xSSC при комнатной температуре, в 70 и 96%-ом этиловом спирта по 15 минут в каждой смене. После высу- цивания на воздухе препараты покрывают фэтоэмульсиейтипа М и экспонируют в тем- н )тедо 10 дней. После проявления стандартным эмидоловым проявителем препараты в течение 2 минут тщательно промывают п эоточной водой и окрашивают 3%-ным р эствором красителя Романовского-Гимза в О 02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 1 )-15 минут. Радиоавтографы анализируют ;

и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 х или 1125 х.

Гибридизация In situ на метафазных хромосомах человека показывает, что кло- 5 нированный фрагмент pBR325 локализован в прицентромерном районе 1-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.

0 Способы использования полученной ре- комбинантной плазмиды альфа-Н -7 идентификации хромосомы I человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики

5 поясняются следующими примерами.

П р и м е р 1. Цельную гепаринизирован- ную кровь здорового донора разводят 0.015М NaCI объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную

0 кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфз- том-500 в соотношении 5:1: смесь отстаивают 30 минут при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при 0- 4°С. Лейкоциты из надосадочной жидкости

5 осаждают центрифугированием при 450д в течение 20 минут и отмывают трехкратным центрифугированием в 0.15М NaCI (450g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50

0 мМ трис HCI (рН 8,0) 5 мМ MgCI, 0,02 mM EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450д. 10 минут).

5Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCI, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением серкозила до концентрации 1 %. Лизэт инкубируют при 65°С

0 не менее 1 часа до полного просветления и центрифугируют 60 минут при 2000 об/мин, для удаления механических примесей. Су- пернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 (Amicon).

5 На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяютотан од- ной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в ка0 тодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCI, 89 мМ ПВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см2 в течение 6-8 часов.

5 После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.

Для препаратиЕ-.ного выделения плаз- мидной ДНК со вставкой ДНК человека

E,Coll, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пентона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCI) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ам- пициллина) при 37°С на качалке в течение 12 часов. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин., 10 мин) и ресуепенди- руют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCI (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствора тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 минут. Затем обьем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65°С. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин, в течение 10 минут. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 часов инкубации при 65°С проводят фенольную. а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным обьемом изо- пропилового спирта (-18°С. 20 мин.), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диазируют на сефадексе G-50 против 0,1xSSC (1xSSC 18 г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 81 °С в течение 10 минут и быстро охлаждают добавлением объема 1М KCI - 20 мМ трис- HCI рН 7.1 приО°С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой NItro-Cell-S (Sen/a) из расчета 1 мг ДНК на 10 см3 объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают 50%-ным изопропиловым или 70%-ным этиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют к буфере ТЕ до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCI (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 минут приО°С.К пробе добавляют 2 мл раствора 0,2 н. NaOH с 1 % SDS и после тщательного перемешивания продолжает инкубацию 5 минут. К лизату добавляют 1.5мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при 0°С. Образующийся осадок удаляют Центрифугированием (1200 об/мин.), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (18°С, 30 мин.). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCI (рН 8,0) + 0,1 М ацетата

натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCI (рН 7.4), 10 мМ MgCI, 10 мМ NaCI и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеаз0 ный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 часов при 37°С. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70°С в течение

5 10 минут или добавлением 1/4 обьема смеси

0,1%-ного раствора SDS. 25%-ного раствора

сахарозы, 5мМ ацетат натрия и 0,05%-ного

раствора бромфенолооого синего.

. Для получения геномной клонотеки

0 ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pBR325 несущую ген устойчивости к ампициллину, и последовательность фага Ми, обуславливающую признак убийства, в которой рзспо5 ложен уникальный сайт для рестриктазы EcoR1. Данное сочетание позволяет проводить одноэтапный отбор рекомбинантных клонов при клонировании фрагмента ДНК человека в EcoRI-сайте плазмиды.

0 Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокули- руют 1 мл свежей ночной культуры E.coli HB 101 выращивают на качалке при 37°С до

5 мутности А 0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 минут, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 10 минут.на хо- лОде. Осадок промывают равным объемом

0 охлажденного до 0°С/ . раствора 100 мМ СаС12, клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл 100 мМ CaCl2. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 минут, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5

5 мл О.Ш CaCI2 с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0°С по крайней мере в течение 30 минут культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80°С, при

0 этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев..

К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0°С добавляют 0,1-0.2 мкг лигиро- ванной ДНК и инкубируют при этой

5 температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42°С) на 60-9.0°С и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 часа при 37°С. Трансформанты высевают на

плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) и добавляют необходимые антибиотики, обуславливающие селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг: плазмидной ДНК или 0,1 мкг препара- ТИЕ но выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М MaCI,5 мМ CaCl2, инкубируют 10 минут при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70°С 10 иинут, после чего к раствору добавляют бус ерный раствор 0,4 М трис-HCI (рН 7,4); 50 М MgCf2, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного ), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из Р- -дезоксинуклеозидтрифосфатов с уде льной активностью 110 ТВ /ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед.ДНК-полиме- ра; ы-1, Объем реакционной смеси, как пра- ви/о, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 часа при 37°С, Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5х108 ими./мин./мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК че/овека в составе гибридных клонов 6ai териальный колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинан- тнь е, репликой наносят на нитроцеллюлоз- ныо фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся негосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выра- щи заютих в течение суток при 37°С. Выросши ; колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0.5 М NaOH и оставляют на 5-10 минут. Подсушив фильтр с нихней стороны фильтровальной бумагой, его дважды по 10 минут обрабатывают раствором 1 м трис-HCI (рН 7,5). а затем 1,5 М NaOl с 1 М трис HCI (рН 7,5). Высушенный на поздухе фильтр помещают в раствор 2xSSC с п )отеиновой К в концентрации 50 мкг/мл и иннубируют в нем 30 минут пои 37°С. Далее подсушенный фильтр промьпзают в 0,3 М Nad, а затем сушат под вакуумом при 80°С в течение 1-2 часа.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68°С в растворе 2xSSC, 0,5 % SOS, 0,1 % фикол-400 и 0,1% поливинилпирроли- -350 в течение 60-90 минут. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гиб- ри изационной смеси, содержащей 6xSSC; 0,1 % SOS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл, поли(А) и денатурированную пробу Р-меченной ДНК с суммарной активностью 1-Ех10°имп./мин. Гибридизацию проводят при 68°С в течение 18-24 часов. Фильтры

промывают в нескольких сменах раствора 0,5xSSC с 0,5% SDS при 68°С в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 часа экспозиции проявляют радиоавтогра- фически и по1 наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

0 Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой EcoR1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной

5 ДНК человека, выделенной препэративно из агарозного геля после злектрофоретиче- ского разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoR1 и идентификации полосы AR1 (340 н.п.). В указан0 ный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых

5 получила название аяьфа-Н1-7.

Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитоге- маглютинина (фирма Difco, США) в

0 пенициллиновых флаконах при 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 часов. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культиви5 рования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендиру- ют в гипотоническом растворе 0,07 М KCI и инкубируют в течение 10 минут при 13°С.

0 Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 минут. Препараты хромосом хранят при 27°С и используют в опытах не позднее 2- 3-х недель после приготовления.

5Образцы ДНК для гидридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деинизированной воды растворяют последовательно 15 мкм десятикратного буферного раствора (0.8 М

0. трис-HCI, рН 7,4; 0,1 М MgCI2); 0,05 М дити- отреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н3-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1

5 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл3Н-тими- динтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), мкл ДНК- полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реацию ведут в течение 20-40 минут при

20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25x106 импульсов в минуту в расчете на 1 мкгДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа-Ш-7 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 секунд в 0,07Н NaOH с последующей промывкой по 10 минут в 70 и 96%-ном этиловом спирте. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2xSSC), в течение 10 минут при 100°С. Гибридизацию проводят при 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2xSSC при 37°С, в двух сменах 2xSSC при комнатной температуре, в 70-96 %-ном этиловом спирте по 15 минут в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловом проявителем в течение 2 .минут препараты тщательно промыват проточной водой и окрашивают 3 %-ным раствором красителя РомановскогоТимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 минут. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 10000х или 1125х.

Гибридизация tn situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа-Р -7 локализуется только в прицентромерном районе 1-ой пары гомологичных хромосом человека и является образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом, специфически маркирующим околоцентро- мерный район.

П р и м е р 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркёра для распознавания 1-й хромосомы в тех случаях, когда эта хромосома (один из гомологов данной пары) затронута перестройкой, т.е. имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 1-й хромосомы и ее форме,

Все процедуры по выделению образца ДНК альфа-НТ-7 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах In situ, а, также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препарара-

ты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора носителя сбалансированной транслокации (переноса) 3/4 части длинного плеча 1-й хромосомы на конец длинного плеча 17-й хромосомы,

В результате такой транслокации длин ное плечо 1-й хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафазной пластинки с данной перестройкой под микроскопом диагностика данного нарушения (потери хромосомного материала) практически невозможна. Однако с помощью молекулярного маркера альфа-В1-7 для 1-й хромосомы гомологичный партнер.с укороченным длинным плечом в этой паре и потеря хромосомного материала в нем легко распознаются непосредственно под микроскопом.

П р и м е р 3, Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера альфа-Р 1-7 для 1-й хромосомы является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине .интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в мета- фазе митоза после специальных обработок,

облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая Х-хромосома, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца полового хроматина, образованного одной из двух Х-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном

ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера альфа-RI-, специфически маркирующего только 1-ю хромосому человека, наличие данной хромосомы в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, а лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК альфа-RI-7 гибридизуется с ДНК прицентромерной области 1-й хромосомы и в том случае, когда эта хромосома находится в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридизации и

приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по размеру скопления (кластеров) зерен серебра (сигналов изотопной метки). В редких случаях можно видеть в интерфазном ядре одно крупное скопление зерен метки, если гомологичные хромосфмы расположены очень близко друг от друга.

i Все процедуры по выделению образца альфа-Р1-7 и его обработки с изотопной NCTKOU для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготов- лению препаратов метафазных хромосом периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в п римерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживаются два скопления гранул метки (два кластера), соответствующих двум гоологичным хромосомам 1-й пары. В разных ядрах расстояния между кластерами различ- н ы. Таким образом, появляется реальная воз- N ожность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретной пары хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения ункциональной организации наследствен- ь ых структур человека.

Таким образом, клонированная после- ;овательность ДНК альфа-К1-7 из генома человека является эффективным инстру-

I6HTOM для распознавания 1-й хромосомы ч еловека как в стандартных (после культиви- рования клеток) препаратах нормальных хромосомных наборов или в случаях с перестройками 1-й хромосомы, так и в цитологи-

ческих (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 1-й хромосомы человека, а также при анализе анеуплоидий по хромосоме I при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.

Формула изобретения Рекомбинантная плазмидная ДНК аль- фа-Р1-7, предназначенная для маркирования l-ой хромосомы человека, размером 4,98 т.п.о., содержащая: -EcoRI-EcoRI-фраг- мент ДНК вектора pBR325 размером 4,3 т.п.о., -EcoRI-EcoRI-фрагмент ДНК центро- мерного района l-ой хромосомы человека размером 0,68 т.п.о., состоящий из четырех тандемно расположенных BspRI-повторов альфоидной ДНК человека размером 0,17 т.п.о. каждый, уникальные сайты рестрикции: четыре BspRI сайта, два EcoRI сайта, генетические маркеры: Атрг-ген устойчивости кампициллину.

Использование: в генетической инженерии и в медицинской генетике для идентификации хромосомы 1 в норме и патологии. Сущность-изобретения заключается втом, что рекомбинантная ДНК содержит геномный фрагмент ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющий четыре внутренних уникальных сайта рестрикции BspR1 с центро- мерным районом хромосомы-1 человека.