ФОТОИНИЦИАТОР ПРОЦЕССА РАЗРУШЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/425 

Изобретение относится к способам разрушения злокачественных клеток в живых организмах и может найти применение для лечения солидных опухолей, для программируемой гибели клеток в биологических и медицинских исследованиях, для фотодинамической терапии рака.

Известно применение порфинов, например фотофрина II в качестве фотоинициатора разрушения клеток под действием красного света. Наиболее вероятными механизмами фотодинамического действия порфинов, как и других красителей, считают их фотопревращение с образованием либо синглетного кислорода, механизм типа I, либо радикалов (механизм типа II). Механизмы типа I и II приводят к накоплению в клетках активных форм кислорода, фотомодификации клеточных мембран, нарушению функционирования клеток и, в конечном итоге, к гибели клеток. Порфины являются недостаточно эффективными, их применение требует весьма больших терапевтических доз. Так, 50%-ная выживаемость мышей с меланомой достигается применением фотофрина II в дозе 10 мг красителя на 1 кг веса мыши при общей дозе облучения 500 Дж/см² светом с длиной волны 630 нм.

Известно также применение в качестве фотоинициатора фотолиза клеток фталоцианиновых красителей. Хлоралюминиевый сульфонат фталоцианина является наиболее эффективным красителем из этого класса: в концентрации 1,3•10^-5 моль/л (11-12 мг/кг) он разрушает эритроциты человеческой крови при дозе облучения 16 Дж/см² светом с длинами волн 660-680 нм. В ранних работах предполагали, что фталоцианины действуют как экзогенные сенсибилизаторы, а механизмы типа I и II не выполняются. Однако в дальнейших работах это предположение не подтвердилось и были получены данные о том, что фталоцианины инициируют фотолиз клеток по механизму типа I образования синглетного кислорода. Фталоцианины не получили широкого распространения в фотодинамической терапии, что может быть обусловлено как их недостаточной эффективностью, так и трудностями их синтеза и очистки.

Известно также применение цианиновых красителей формулы

в качестве фотоинициатора фотолиза клеток. Цианиновые красители обладают определенными преимуществами по сравнению с предыдущими красителями: они селективно на- капливаются в злокачественных клетках и удерживаются в них дольше, чем в здоровых клетках, из-за повышенного мембранного потенциала злокачественных клеток. Поэтому цианиновые красители являются перспективными фотоинициаторами селективного фотолиза злокачественных клеток в опухолях. На примере мероцианина-540 показано, что цианиновые красители являются фотоинициаторами радикально-цепного окисления липидов. Разрушение 90% злокачественных клеток в их присутствии обычно происходит при дозах облучения около 60 Дж/см² светом с длинами волн 630-670 нм, что недостаточно для полного излечения. Из данных красителей наиболее известен криптоцианин (R₁=R₂= C₂H₅), который тормозит развитие опухолей у мышей при многократном повторении процедуры инъекции красителя с последующим облучением опухоли. Механизм фотодинамического действия криптоцианина заключается в фотоинициировании окислительных процессов, приводящих к накоплению в клетке продуктов, которые ингибируют оксидо-редуктазы, что приводит к последующей медленной гибели злокачественных клеток [2]
Приведенные данные показывают, что эффективность известных красителей, применяемых для ФДТ, является недостаточной. Целью изобретения является повышение эффективности процесса разрушения злокачественных клеток в живых организмах.

Указанный эффект достигается применением в качестве фотоинициатора фотолиза злокачественных клеток в живых организмах тиодикарбоцианинового красителя формулы

Соединение формулы (I) применяется в качестве спектрального сенсибилизатора галогенсеребряных фотографических эмульсий к области спектра 650-790 нм с максимумом сенсибилизации при 745-750 нм [1]
Получают соединение (I) взаимодействием четвертичной соли 2-метил-3-этил-5-метокси-6-метилтиобензтиазола формулы

с производным 1,3,3-триэтилтио-1-циклогексена формулы

в расплаве этилового эфира п-толуол-сульфокислоты с последующей конденсацией полученного соединения формулы

с четвертичной солью 2-метил-3-этил-5-метокси-6-метилтиобензтиазола формулы (II) в присутствии триэтиламина в среде пиридина при кипении или в среде диметилацетамида при температуре 150-155^o [1]
Соединение I (полиметин) доступно, освоено в промышленном производстве на опытном заводе Казанского ПО "Тасма".

Применение полиметина в качестве фотоинициатора фотолиза злокачественных клеток в живых организмах позволяет существенно повысить эффективность фотолиза при меньших дозах облучения по сравнению с аналогом криптоцианином. Клетки насыщают полиметином при его концентрациях 1-4 мг/кг и облучают светом с длинами волна 660-760 нм до дозы облучения 10-130 Дж/см².

Нижеследующие примеры иллюстрируют данное изобретение, но не ограничивают его.

Пример 1. Из брюшной полости мыши шприцом отбирают 0,1 мл асцитической жидкости, содержащей опухолевые клетки Р388, разводят буферным раствором Хенкса до концентрации 1•10⁶ клеток/мл. В полученную суспензию клеток Р388 добавляют полиметин до концентрации 5•10^-6 моль/л и выдерживают 30 мин для насыщения клеток полиметином. Затем 1 мл клеток оставляют для контроля в темноте, а другой 1 мл клеток облучают при комнатной температуре светом с длинами волн 660-760 нм до дозы облучения 10 Дж/см². Количество поврежденных клеток N после облучения измеряют по окрашиванию бромистым этидием и флуоресцеиндиацетатом. Для определения эффективности полиметина по отношению к криптоцианину выполняют ту же процедуру, но вместо полиметина использую криптоцианин. Эффективность полиметина E определяют как величину E=N₁/N₀, где N₁ и N₀ количество поврежденных клеток при использовании в качестве фотоинициатора полиметина и криптоцианина соответственно. Измерения N₁ и N₀ дают N₁=12% N₀=5% и E=2,4 (табл.1). Таким образом, при дозе 10 Дж/см² эффективность полиметина в 2,4 раза выше, чем у криптоцианина.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что доза облучения составляет 30 Дж/см². Измерения N₁ и N₀ дают N₁=16% N₀=4% и E=4,0 (табл.1). Таким образом, при дозе 30 Дж/см² эффективность полиметина в 4 раза выше, чем криптоцианина.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что доза облучения составляет 60 Дж/см². Измерения N₁ и N₀ дают N₁=21% N₀=14% и E=1,5 (табл. 1). Это показывает, что при дозе 60 Дж/см² эффективность полиметина в 1,5 раза выше, чем криптоцианина.

Пример 4. Из брюшной полости мыши шприцом отбирают 0,1 мл асцитической жидкости, содержащей опухолевые клетки L1210, разводят буферным раствором Дульбекко до концентрации 1•10⁶ клеток/мл. В полученную суспензию клеток L1210 добавляют полиметин до концентрации 5•10^-6 моль/л и выдерживают 10-30 мин для насыщения клеток полиметином. Затем 1 мл клеток оставляют для контроля в темноте, а другой 1 мл клеток облучают при комнатной температуре светом с длинами волн 660-760 нм до дозы облучения 130 Дж/см². По окрашиванию флуоресцеиндиацетатом наблюдается повреждение 100% клеток, а в контроле 5% клеток.

Пример 5. Получение клеток L1210 с добавкой полиметина и их облучение выполняют аналогично примеру 4 с тем отличием, что суспензию клеток разводят физиологическим раствором до концентрации 2•10⁷ клеток/мл, а обучение проводят до дозы 60 Дж/см². Облученную суспензию клеток вводят внутрибрюшинно здоровым мышам-гибридам C57/DBA по 0,2 мл суспензии на каждую мышь и наблюдают за развитием у мышей лимфоидного лейкоза L1210. По мере гибели мышей определяют времена t₁₀₀, t₆₀ и t₄₀ продолжительности жизни 100% 60% и 40% мышей соответственно от начала заболевания. Все три величины t₁₀₀, t₆₀ и t₄₀ превышают 120 сут (табл.2), что свидетельствует о полном разрушении клеток L1210 при их фотолизе in vitro с использованием в качестве фотоинициатора полиметина.

Примеры 6-10. Выполняют аналогично примеру 5, но при других концентрациях фотоинициатора и дозах облучения, причем примеры 8-10 сравнительные. Данные представлены в табл.2. Как следует из данных табл.2, фотолиз in vitro в присутствии 5•10^-7 моль/л фотоинициатора значительно увеличивает продолжительность жизни мышей, причем эффективность предлагаемого фотоинициатора полиметина существенно выше, чем известного фотоинициатора криптоцианина при меньших дозах облучения.

Повышенная эффективность предлагаемого фотоинициатора при меньших дозах облучения важна для разрушения глубоко лежащих клеток в солидных опухолях, которые получают меньшие дозы облучения, чем клетки в поверхностных слоях опухоли.

Пример 11. Из брюшной полости мыши отбирают 0,1-0,5 мл асцитической жидкости, содержащей опухолевые клетки Р388, разводят ее физиологическим раствором таким образом, чтобы 0,1 мл суспензии содержал 1,5•10⁵ клеток Р388 и вводят по 0,1 мл полученной суспензии мышам-гибридам С57/ДВА подкожно в область лопатки передней конечности для развития солидной опухоли. Среднюю массу растущей опухоли определяют ее взвешиванием после вскрытия мышей. На 5-й день развития опухоли начинают проводить фотодинамическую терапию, которая заключается в следующем: мышам вводят полиметин внутрибрюшинно из расчета 1 мг фотоинициатора на 1 кг веса мыши и оставляют мышей в темноте на 1 сут для накопления фотоинициатора в опухоли. Через 24 ч после инъекции полиметина опухоль облучают аналогично примеру 5 до дозы 80 Дж/см² под общим наркозом для фиксации мыши.

Данные о развитии опухоли до и после фотодинамической терапии приведены на чертеже.

Как следует из чертежа, уже одноразовое применение фотодинамической терапии с предлагаемым фотоинициатором полиметином останавливает рост солидной опухоли Р388 у мышей-гибридов С57/ДВА. Паталогоанатомический анализ показывает также полное прекращение прорастания кровеносных сосудов в опухоли, что свидетельствует о высокой эффективности предлагаемого фотоинициатора.

Пример 12. Является сравнительным и выполняется аналогично примеру 11, но без использования полиметина. Полученные данные приведены на чертеже и показывают, что без применения полиметина происходит быстрый рост опухоли, приводящий к гибели мышей.

Полиметин вводили внутрибрюшинно (1 мг/кг) за сутки до облучения красным светом. Процедуру облучения опухоли проводили однократно в течение 40 мин под общим наркозом для фиксации мыши. Дата процедуры на чертеже указана стрелкой. Точки на 11-е сутки являются среднестатистическими (20 мышей на точку), остальные индивидуальными.

Таким образом, предлагаемый фотоинициатор полиметин обладает рядом преимуществ по сравнению с известными фотоинициаторами. Благодаря положительному заряду полиметин селективно накапливается в злокачественных клетках и удерживается в них дольше, чем в здоровых клетках, из-за повышенного мембранного потенциала злокачественных клеток, что важно для селективного фотолиза злокачественных клеток. Полиметин эффективно подавляет рост солидной опухоли у мышей и разрушает злокачественные клетки in vitro. При меньших дозах облучения его эффективность в 1,5-4,0 раза превосходит эффективность известного фотоинициатора криптоцианина, что важно для терапии глубоко лежащих клеток в опухоли. Наконец, полиметин является доступным соединением, освоенным в промышленном производстве.

Изобретение относится к способам разрушения злокачественных клеток в живых организмах и может найти применение для лечения солидных опухолей, для программируемой гибели клеток в биологических и медицинских исследованиях, для фотодинамической терапии рака. Целью изобретения является повышение эффективности процесса разрушения злокачественных клеток в живых организмах. Технический эффект достигается применением в качестве фотоинициатора фотолиза злокачественных клеток в живых организмах тиодикарбоцианинового красителя формулы
,
(X = CH₃C₆H₄SO-3

). Предлагаемый фотоинициатор полиметин обладает рядом преимуществ по сравнению с известными фотоинициаторами. Благодаря положительному заряду полиметин селективно накапливается в злокачественных клетках, эффективно подавляет рост солидной опухоли у мышей и разрушает злокачественные клетки in vitro. При меньших дозах облучения его эффективность в 1,5-4,0 раза превосходит эффективность известного фотоинициатора криптоцианина, что важно для терапии глубоко лежащих клеток в опухоли. 1 ил., 2 табл.

Применение тиодикарбоцианового красителя формулы

в качестве фотоинициатора процесса разрушения злокачественных клеток в живых организмах.