Изобретение относится к медицине, а именно к средствам для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний.
В последние годы метод ФДТ раковых опухолей интенсивно развивается. Суть метода заключается во введении в организм человека туморотропного тетрапиррольного фотосенсибилизатора (ФС), который накапливается на липидном бислое опухолевых клеток и под действием видимого света активирует кислород воздуха до синглетной активной формы. Синглетный кислород окисляет клеточные компоненты и инициирует каскад процессов, приводящих к гибели опухолевых клеток.
Однако степень воздействия ФС на клетки остается невысокой, поскольку время жизни синглетного кислорода в клетке не превышает 10 мкс.
В настоящее время проблема повышения эффективности ФС при ФДТ решается за счет поиска новых типов ФС, синтеза сложных фотосенсибилизирующих систем и создания средств на основе ФС, иммобилизованных на полимерном или липосомном носителе, повышающих способность ФС проникать через липидные мембраны непосредственно внутрь клетки.
Главными недостатками этих направлений являются сложность получения новых ФС и фотосенсибилизирующих систем и высокая иммуногенность иммобилизованных ФС.
Известно средство для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний, содержащее производные хлорина е6 в лиофилизированной форме и медицинский поливинилпирролидон при следующем соотношении компонентов: хлорин е6 - 40-90%, поливинилпирролидон - 60-10% (RU 2152790, А61К 31/79, 20.07.2000).
Недостатком данного средства является высокая токсичность.
Известно средство для флуоресцентной диагностики и ФДТ онкологических и неонкологических заболеваний (RU 2219921, А61К 31/195, 47/06, 47/30, А61Р 35/00, 27.12.2003 - прототип) в виде буккальной пластинки-пастилки для рассасывания на основе просенсибилизатора - гидрохлорида 5-аминолевуленовой кислоты, в котором просенсибилизатор иммобилизован в биорастворимом полимере, модифицированном смесью гидрофильных и липофильных компонентов. Биорастворимый полимер в данном известном средстве представляет собой тройной сополимер N-винилпирролидона, этилакрилата и акриламида. В качестве гидрофильного модифицирующего компонента средство может содержать глицерин или полиэтиленоксид, в качестве липофильного - дисперсию жиров.
Недостатком известного средства-прототипа является его крайне низкая эффективность и высокая иммуногенность, так как для создания необходимой для эффективной ФДТ концентрации ФС в пораженных клетках потребуется ввести в организм избыточное количество лекарственного средства, что неизбежно приведет к возникновению серьезных побочных эффектов.
Задачей настоящего изобретения является создание средства для лечения злокачественных опухолей методом ФДТ, которое обеспечит высокую эффективность действия ФС и позволит существенно снизить иммуногенность и токсичность препарата.
Решение поставленной задачи достигается предлагаемым средством для лечения злокачественных опухолей методом фотодинамической терапии, включающим фотосенсибилизатор и биорастворимый полимер, которое дополнительно содержит амфифильную транспортирующую добавку, представляющую собой блок-сополимер пропиленоксида и этиленоксида, а в качестве биорастворимого полимера - амфифильный водорастворимый полимер, выбранный из группы, включающей натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, поливиниловый спирт, сульфат хитозана, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
В качестве фотосенсибилизатора средство может содержать димегин: динатриевую соль 2,7,12,18-тетраметил-3,8-ди(1-метоксиэтил)-13,17-ди(2-оксикарбонилэтил)порфирина, или фотогем: гематопорфирин, или фотодитазин: ди-(N-метилглюкаминовую) соль 3-винил-13-карбокси-15-карбоксиметил-17-(2-карбокси-этил)-2,7,12,18-тетраметил-8-этил-17,18-ди-гидропорфирина (ди-N-метилглюк-аминовая соль хлорина Е6), или фотосенс: сульфированный фталоцианин алюминия.
При разработке предлагаемого средства нами были проведены экспериментальные исследования влияния структуры тетрапиррольных ФС, природы водорастворимого амфифильного полимера, молярного соотношения полимер/ФС и других параметров на эффективность воздействия ФС на культуры опухолевых клеток в условиях освещения.
Было показано, что в качестве ФС в предлагаемом средстве можно использовать все применяющиеся в настоящее время тетрапиррольные ФС. В частности, нами были исследованы димегин, фотодитазин, фотосенс, гематопорфирин (фотогем). Фотосенс и фотодитазин используются в медицинской практике, фотогем и димегин проходят клинические испытания. Амфифильные водорастворимые полимеры, используемые в предлагаемом средстве, должны быть биосовместимыми и нетоксичными и, кроме того, не должны уменьшать фотокаталитические свойства ФС. Таким требованиям отвечают следующие хорошо растворимые в воде амфифильные полимеры: поливиниловый спирт (Мw=90000), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) (Мw=250000, степень замещения гидроксильных групп целлюлозы - 1,2), сульфат хитозана (Mw=70000, степень сульфирования аминогрупп хитозана - 0,8).
Данные атомно-силовой микроскопии позволяют предполагать, что используемые нами амфифильные водорастворимые полимеры (КМЦ, поливиниловый спирт, сульфированный хитозан) образуют с ФС водорастворимые полимерные комплексы, при этом ФС встраиваются в структуру полимеров в виде небольших ассоциатов (по 20-40 молекул ФС). Методом флуоресцентной спектроскопии было установлено, что присутствие амфифильных полимеров не повышает проницаемость клеточных мембран по отношению к ФС, следовательно, используемые в предлагаемом средстве амфифильные водорастворимые полимеры не могут выступать в роли транспортирующего агента по отношению к ФС. Кроме того, было показано, что предварительное экспонирование комплексов ФС-амфифильный полимер с опухолевыми клетками в течение 24 часов с последующим отмыванием избытка комплекса перед сеансом ФДТ не приводит к повышению эффективности действия ФС. Это свидетельствует о воздействии комплекса ФС-полимер на опухолевые клетки именно в момент освещения. Возможно, изученные амфифильные полимеры при освещении дополнительно блокируют ферментативные системы (в частности, окислительно-восстановительные) опухолевых клеток, или, локализуясь на дефектах в клеточных мембранах, образовавшихся в результате повреждающего действия синглетного кислорода, препятствуют регенерации клеток, что приводит к повышению эффективности воздействия ФС в комплексе с полимером по сравнению с воздействием свободных ФС.
Нами было исследовано также влияние различных полимерных и низкомолекулярных добавок на процесс проникновения ФС, связанных с водорастворимым амфифильным полимером, через клеточные мембраны. Механизм проникновения ФС, иммобилизованных на полимерном или липосомном носителе, через липидные мембраны клеток еще недостаточно изучен. Используемые для стимулирования проникновения реагенты являются очень различными по своей природе, так как все они найдены эмпирически. Следовательно, априори никакое соединение нельзя считать подходящим для данного применения. К тому же имеются соединения, которые способны повышать проницаемость клеточных мембран только в смеси с другими реагентами. Полученные нами экспериментальные данные позволили установить, что добавка сополимеров полиалкиленоксидов к используемым в средстве водорастворимым амфифильным полимерам (натриевая соль КМЦ, поливиниловый спирт, сульфат хитозана) увеличивает проницаемость клеточных мембран по отношению к ФС, что повышает эффективность действия ФС при ФДТ. По-видимому, полиалкиленоксиды способны встраиваться в липидный бислой клеточной мембраны, нарушая при этом жидкокристаллическую структуру мембраны. Такая способность полиалкиленоксидов будет не только облегчать проникновение ФС внутрь клетки, но будет еще и тормозить выведение ФС из раковой клетки, что также повышает эффективность действия ФС. Исследование сополимеров полиалкиленоксидов показало, что в предлагаемом средстве желательно использовать блоксополимер пропиленоксида и этиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 10000-12000.
Заявляемое средство, содержащее ФС и амфифильный водорастворимый полимер с добавкой ПЭО, может быть использовано в ФДТ злокачественных опухолей. При лечении опухолей поверхностной локализации средство можно использовать в виде полимерных пленок, гелей или пен. При этом средство постепенно рассасывается на поверхности опухоли и переходит в ее более глубокие слои. Применение ФС в таком виде позволяет решить сразу несколько проблем ФДТ: во-первых, отпадает необходимость во внутривенном, внутримышечном или подкожном введении ФС в организм пациента (что всегда сопровождается передозировкой лекарственного средства), а, во-вторых, исключается светотоксическое воздействие ФС на организм (загрязнение его продуктами фотодеструкции ФС).
Предлагаемое средство получают следующим образом. К водному раствору полимеров добавляют ФС и перемешивают. При использовании средства в виде геля или пленки воду частично или полностью испаряют.
Экспериментальные исследования при разработке предлагаемого средства и анализ эффективности его фотодинамического воздействия проводились в Институте химической физики им. И.И.Семенова РАН, Медицинском радиологическом научном центре, Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина и на Кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.
Анализ эффективности фотодинамического воздействия предлагаемого средства на опухолевые культуры проводили на разных типах культур, поскольку каждая клеточная линия согласно своим генотипическим и фенотипическим характеристикам обладает своим уровнем лекарственной устойчивости (чувствительности к каждому классу цитостатических, фотодинамических и других агентов, а также антибиотиков). Тестирование фотоцитотоксического эффекта предлагаемого средства и, в качестве контроля, исходных ФС проводили методом МТТ на двух линиях опухолевых клеток, обладающих различающейся пролиферативной активностью и лекарственной чувствительностью: Skov-3 (карцинома яичника человека, Кливлэнд, США) и HBL-100 (аденокарцинома молочной железы человека, Петербург, США) - это адгезионные культуры, обладающие сходным пролиферативным потенциалом и морфологическим типом.
Метод МТТ определения IC50 - минимальной концентрации реагента, при которой погибают 50% подвергнутых обработке клеток, заключается в следующем. Культуры клеток рассеваются в 96-луночные планшеты (объем лунки - 0,2 мл). Клетки рассевались тетраплетами по 4 лунки на один образец (раствор, содержащий одинаковое количество предлагаемого средства или контроля - свободного ФС) с промежутком в один ряд для того, чтобы при облучении избежать влияния рассеянного на пластике излучения на соседние образцы. Реагенты вносятся через 24 часа после рассева. Концентрации предлагаемого средства рассчитывают исходя из того, чтобы IC50 попадала в середину панели. Для построения графика определения IC50 вносят в лунки 8-15 различных концентраций. Всего в одном опыте тестировали 12 образцов, последний боковой ряд лунок (8 шт.) использовали для контроля. Облучение планшета начинали через 90 минут после введения образцов.
Облучение проводили снизу, поскольку адгезионные культуры растут на поверхности дна лунок планшета. При работе с фотодитазином и фотосенсом использовали лазерный аппарат «Аткус-04» с длиной волны 662 нм и регулируемой выходной мощностью 20-400 мВт. Излучение по кварцевому моноволокну, закрепленному в зажиме, подавалось на нижнюю поверхность планшета. Контроль энергетических параметров облучения проводили калиброванным измерителем средней мощности ИМО-4С. Были выбраны следующие параметры облучения: плотность мощности - 50 мВт/см2 при 12 Дж/см2 или 3 Дж на лунку. В этих условиях время облучения одного образца составляло 4 мин, а всего 96-луночного планшета - 48 мин.
При работе с димегином и фотогемом использовали аппарат АФС-К на сверхъярком светодиоде с максимумом излучения 628 нм, средней мощностью излучения р≥50 мВт. При интегральном выходе излучения с моноволокна 63 мВт в плоскости облучения 225 мм2 на плоскость облучения образца приходится 45 мВт или 12 Дж/см2 - 3 Дж на лунку при 10 мин экспозиции. Для достижения необходимой дозы облучения время экспозиции одного образца должно составлять 10 мин, а целого планшета - 120 мин.
Через 48-96 часов после облучения вносят реагент для регистрации дегидрогеназной активности ферментов выживших клеток по образованию сине-фиолетовых кристаллов фармазана - 3-(4,5-диметилтиазолил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ реагент) из расчета концентрации 0,5 мг/мл (или 10 мкл из «stock» раствора 5 мг/мл на лунку). Затем отбирают культуральную среду, не повреждая монослой клеток, лизируют клетки в 60 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) на лунку и снимают показатели оптической плотности на плашечном ридере (Multiscan).
Расчет процента гибели клеток (X) проводили по формуле:
Х=(ODsample/ODcontrol)•100%.
Методом МТТ для культур HBL-100 и Skov-3 экспериментально определили минимальные концентрации свободных ФС в водных растворах, вызывающие 50%-ную гибель клеток - IC50, которые в дальнейших экспериментах служили контролем для тестирования фотоцитотоксического эффекта заявляемого средства.
Для подтверждения лечебной эффективности заявленного средства были проведены опыты на лабораторных животных. На левые задние стопы самцов мышей в возрасте 3 месяцев (использовались мыши линии BALB/c и гибриды F1 (CBA×C57B1/6) осуществлялась подкожная прививка опухолей - асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) и карциномы легких Льюис (КЛЛ). Прививка опухолей проводилась за 8 суток до ФДТ путем введения 105 опухолевых клеток, что позволяло к моменту воздействия иметь подкожные опухоли объемом 6-9 мм3. Для оценки эффективности предлагаемого средства на пораженный опухолью участок стопы животного (мышей предварительно наркотизировали) наносили средство в виде геля, содержащего 0,2% димегина и выдерживали 15-20 мин, затем этот участок кожи подвергали локальному воздействию света в течение 10-60 мин. В качестве источника света использовали лазер с длиной волны 680 нм.
Для оценки реакции опухолей на фотодинамическое воздействие использовали следующие показатели:
1) прирост объема опухоли в течение последующих 13 суток (для обоих типов опухолей);
2) число метастазов в легких на 21 сутки после прививки опухоли (для опухоли КЛЛ).
Приводим примеры исследования фотоцитотоксического эффекта и лечебной эффективности заявляемого средства.
А. Исследования фотоцитотоксического эффекта.
Пример 1.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Для тестирования фотоцитотоксического эффекта средства использовались клеточные линии Skov-3 (карцинома яичника человека, Кливлэнд) и HBL-100 (аденокарцинома молочной железы человека, Питербург). Средство указанного состава (отношение ФС к полимерам ˜1:300 масс.) вносили в культуральную среду в виде водного раствора. Средние концентрации ФС в средстве, вызывающие 50%-ную гибель клеток (IC50), определяли по методу МТТ, для облучения использовали лазерный аппарат «Аткус-04» с длиной волны 662 нм. Были выбраны следующие параметры облучения: 12 Дж/см2 или 3 Дж на лунку.
Средняя величина IC50 для средства в случае HBL-100 составляет 1,5·10-7 М, для Skov-3 - 1,5·10-7 М. Наблюдается значительное (в 600 и 90 раз) усиление фотоцитотоксического эффекта по сравнению со свободной формой фотодитазина, IC50 для которой составляет 9·10-5 М и 1,35·10-5 М, соответственно.
Пример 2.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Тестировались клеточные линии Skov-3 (карцинома яичника человека) и HBL-100 (аденокарцинома молочной железы человека). Средство указанного состава (отношение ФС к полимерам ˜1:100, масс.) вносили в культуральную среду в виде водного раствора. Эксперимент проводили по методу МТТ, для облучения использовали аппарат АФС-К на сверхъярком светодиоде с максимумом излучения 628 нм, средней мощностью излучения р≥50 мВт. При интегральном выходе излучения с моноволокна 63 мВт в плоскости облучения 225 мм2 на плоскость облучения образца приходится 45 мВт или 12 Дж/см2 (3 Дж на лунку) при 10 мин экспозиции. Для достижения необходимой дозы облучения время экспозиции одного образца должно составлять 10 мин.
Средние величины IC50 для средства в случае HBL-100 и Skov-3 составляют 2,5·10-6 М. По сравнению со свободной формой димегина, IC50 которой составляет 6,5·10-6 М для HBL-100 и 1,5·10-5 М для Skov-3, наблюдается усиление фотоцитотоксического эффекта в 2,6 раза и в 6 раз, соответственно.
Пример 3.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Тестирование фотоцитотоксического эффекта средства проводили так же, как в примере 1.
Средняя величина IC50 для средства в случае HBL-100 составляет 6·10-7 М, для Skov-3 - 2,5·10-7 М. Наблюдается значительное (в 50-150 раз) усиление фотоцитотоксического эффекта по сравнению со свободной формой фотодитазина (IC50 составляет 9·10-5 М и 1,35·10-5 М, соответственно).
Пример 4.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Тестирование фотоцитотоксического эффекта средства проводили так же, как в примере 1.
Средняя величина IC50 для средства в случае HBL-100 составляет 2,5·10-7 М, для Skov-3 - 3,0·10-7 М; наблюдается усиление фотоцитотоксического эффекта по сравнению со свободной формой фотодитазина (9·10-5 и 1,35·10-5 М, соответственно) в 360 и 45 раз, соответственно.
Пример 5.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Тестирования фотоцитотоксического эффекта средства проводили так же, как в примере 1.
Средняя величина IC50 для средства в случае HBL-100 составляет 1,25·10-7 М, для Skov-3 - 2,5·10-7 М. Наблюдается значительное (в 80 и 60 раз) усиление фотоцитотоксического эффекта по сравнению со свободной формой фотосенса (IC50 составляет 1·10-3 и 1,5·10-5 М, соответственно).
Пример 6.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Тестирования фотоцитотоксического эффекта средства проводили так же, как в примере 2.
Средняя величина IC50 для средства в случае HBL-100 составляет 1,5·10-6 М, для Skov-3 - 2·10-6 М. Наблюдается усиление фотоцитотоксического эффекта в 4 и 5 раз по сравнению со свободной формой фотогема, IC50 для которой составляет 6·10-6 и 1·10-5 М, соответственно.
Б. Исследование лечебной эффективности средства (опыты на животных).
Пример 7.
Исследовалось средство следующего состава, мас.%:
Лекарственное средство указанного состава использовали в виде 20%-ного водного геля, который хранили в таре из темного стекла. Тонкий слой геля наносили на кожу левой задней стопы мышей (использовались мыши линии BALB/c), пораженную опухолью асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). В каждой экспериментальной группе было по 12 мышей. Оценка уровня торможения роста опухоли проводилась по изменению ее объема на 21 сутки после прививки опухоли в контрольной и опытных группах. Наибольший лечебный эффект наблюдался при воздействии света в течение 40 мин, когда наблюдалось не только торможение роста опухоли, но и полное ее рассасывание. При этом уровень реакции окружающих опухоль нормальных тканей находился на уровне толерантного повреждения (влажный эпидермит, который зажил в течение последующих 3-4-х недель). Наблюдение в течение последующих 120 суток не выявило ни одного случая рецидива роста опухоли.
Пример 8.
Тонкий слой такого же геля, как в примере 7, наносили на кожу левой задней стопы мышей (использовались мыши-гибриды F1(CBA×C57B1/6), пораженную опухолью карциномы легких Льюис (КЛЛ). В каждой экспериментальной группе было по 12 мышей. Оценка уровня торможения роста опухоли и ослабления метастазирования в легкие проводилась по изменению объема опухоли и по изменению числа легочных метастазов на 21 сутки после прививки опухоли в контрольной и опытных группах. У мышей, подвергшихся воздействию света в течение 40 минут, наблюдалось торможение роста опухоли у всех животных и ослабление метастазирования в легкие на 95% по сравнению с контрольной группой. Было отмечено, что проведение ФДТ у мышей-гибридов F1(CBA×C57B1/6) с привитой опухолью КЛЛ сопровождается существенно меньшим повреждением кожи, чем у мышей линии BALB/c с привитой опухолью АКЭ. Даже при максимальных световых нагрузках на кожу у мышей-гибридов с опухолью КЛЛ не наблюдалось развития влажного эпидермита.
Таким образом, из приведенных данных видно, что предлагаемое средство обеспечивает высокую эффективность действия ФС - наблюдаются значительное усиление фотоцитотоксического эффекта по сравнению со свободной формой ФС и высокая лечебная эффективность. Кроме того, средство позволяет существенно снизить иммуногенность и токсичность препарата.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ оптимизации фотодинамической терапии гнойных ран (варианты) | 2015 |
|
RU2609735C1 |
| ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ ЖИВОТНОГО | 2015 |
|
RU2604412C2 |
| СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПЕРЕВИВНОЙ ОПУХОЛИ КАРЦИНОМА ЭРЛИХА МЫШЕЙ С ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ ХЛОРИНОВОГО РЯДА | 2022 |
|
RU2788766C2 |
| ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ ЖИВОТНОГО | 2015 |
|
RU2604388C2 |
| ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ | 2005 |
|
RU2282646C1 |
| ВОДОРАСТВОРИМАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА МЕЗО-ТЕТРА(3-ПИРИДИЛ)БАКТЕРИОХЛОРИНА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ | 2017 |
|
RU2663900C1 |
| КОМПОЗИЦИЯ ГИДРОГЕЛЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕФЕКТОВ ПОКРОВНЫХ ТКАНЕЙ МЕТОДОМ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ | 2020 |
|
RU2730850C1 |
| Монокатионный хлориновый фотосенсибилизатор для фотодинамической инактивации опухолевых клеток | 2022 |
|
RU2792003C1 |
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ ЯЗВ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ | 2011 |
|
RU2457873C1 |
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛЕЙКОЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ | 2009 |
|
RU2410091C1 |
Изобретение относится к медицине, а именно к средствам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных опухолей. Средство содержит фотосенсибилизатор, амфифильную транспортирующую добавку и амфифильный водорастворимый полимер. Амфифильная транспортирующая добавка представляет собой блок-сополимер пропиленоксида и этиленоксида. Амфифильный водорастворимый полимер выбран из натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, поливинилового спирта, сульфата хитозана. В качестве фотосенсибилизатора средство содержит или димегин, или фотогем, или фотодитазин, или фотосенс. Изобретение обеспечивает высокую эффективность действия фотосенсибилизатора - наблюдается значительное усиление фотоцитотоксического эффекта. Средство позволяет снизить иммуногенность и токсичность препарата. 3 з.п. ф-лы.
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ С ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ | 1996 |
|
RU2123326C1 |
| СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМАНГИОМ КОЖИ | 1995 |
|
RU2121387C1 |
| RU 2073016 C1, 10.02.1997 | |||
| СРЕДСТВО ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 1999 |
|
RU2152790C1 |
| ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2004 |
|
RU2276976C2 |
| СРЕДСТВО ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ И НЕОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2002 |
|
RU2219921C1 |
