СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ VI-АНТИГЕНА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/66 

Изобретение относится к области инфекционной иммунологии, а именно к способу получения антигена бактериального происхождения. И может быть использовано для создания препаратов, применяемых для иммунодиагностики и иммунопрофилактики брюшного тифа.

Известен способ получения Vi-антигена, в основе которого лежит выделение его из сухих клеток Citrobacter freundii. Полисахаридный антиген удаляют с поверхности бактериальных клеток встряхиванием с физиологическим раствором, полученный экстракт обрабатывают нуклеазами и проназой. Vi-антиген после высаживания спиртом и растворения в физиологическом растворе осаждают в виде соли с цитилтриметиламмоний бромидом (Цетавлон). Полученный осадок растворяют в 1M KCl и далее очищают высаживанием из спирта. Обработку цетавлоном повторяют до полного отсутствия соматических антигенов [1] Выход очищенного антигена составляет 6 мг/г сухих бактериальных клеток. Чистота продукта контролируется с помощью УФ-спектроскопии (отсутствие нуклеиновых кислот), а также серологически.

Недостатками метода является относительно низкий выход, связанный с многостадийностью процесса выделения, а также длительность и сложность каждой стадии способа.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и получаемому результату является способ получения Vi-антигена, заключающийся в том, что клетки Salmonella paratyphi культивируют на питательный среде, надклеточную жидкость отделяют центрифугированием, обрабатывают водным раствором цетавлона, образовавшуюся соль обрабатывают 1М раствором NaCl и высаживают спиртом. Полученный антиген очищают действием нуклеаз (DNase и RNase) и протеазы, экстракцией фенолом и ультрацентрифугированием. Выход антигена 1,6 мг/л культуры с содержанием белка и нуклеиновых кислот менее 1% [2] Известный способ включает большое число стадий, на каждой из которых возможны неконтролируемые потери.

Цель изобретения упрощение технологического процесса.

Поставленная цель достигается предложенным способом получения Vi-антигена, который заключается в том, что микроорганизм Citrobacter freundii или Salmonella paratyphi культивируют на питательной среде, супернатант отделяют, стерилизуют микрофильтрацией, фильтрат концентрируют, ультрацентрифугируют, обрабатывают ферментами, а затем подвергают гель хроматографии.

Отличием способа является то, что культивируют клетки Citrobacter freundii или Salmonella paratyphi, после отделения супернатанта последний стерилизуют микрофильтрацией, фильтрат концентрируют, ультрацентрифугируют, обрабатывают ферментами, а затем подвергают гель хроматографии.

Более подробно способ осуществляют следующим путем. Микроорганизм Citrobacter или Salmonella typhi культивируют на питательной среде, бактериальные клетки отделяют центрифугированием, супернатант стерилизуют микрофильтрацией с использованием мембран с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат концентрируют с помощью системы ультрафильтрации "Пелликон" или "Амикон" до объема 0,1 0,2 от исходного и подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g. Полученный супернатант обрабатывают дезоксирибо- и рибонуклеазами затем протеазой. Реакционную смесь наносят на колонку, заполненную Сефарозой или Сефадексом Трис-HCl/NaCl буфере, pH 8,0, содержащем ЭДТА и NaN³ и после гельхроматографии получают очищенный Vi-антиген с выходом 2-4 мг с литра культуральной жидкости с содержанием белка менее 1% и 1-1,5% нуклеиновых кислот.

Предложенный способ позволяет упростить процесс за счет исключения необходимости работы с многолитровыми объемами наклеточной жидкости и связанными с этим много кратными центрифугированиями больших количеств суспензий бактериальных клеток, цетавлоновых солей, а также Vi-антигена (в спирте).

Проверка предложенного способа на соответствие его критерию "изобретательский уровень" показала, что ни в научной, ни в патентной литературе, не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения.

Пример 1. Микроорганизм Salmonella typhi штамм Ty2 4446 культивируют на питательной среде, содержащей, г/л: K₂HPO•3H₂O 10; KH₂PO₄ 4,5 MgSO₄•7H₂O 0,05; (NH₄)₂SO₄ 1; цитрат Na 0,97; глюкоза 40% 7 мл/л; аминопептид 2,5 мл/л в течении 6 ч до оптической плотности 0,5 (OE). Бактериальные клетки отделяют центрифугированием. Супернатант стерилизуют микрофильтрацией с использованием мембран с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат концентрируют с помощью системы ультрафильтрации "Пелликон" или "Амикон" до объема 0,1% от исходного и далее подвергают ультрацентрифугированию при 105000 g в течение 16 ч. Полученный супернатант обрабатывают дезоксирибо- и рибонуклеазами (10 γ/мл и 50 g/мл соответственно) в течение 6 часов при 37^o и далее проназой (10 g/мл) в течение 16 ч при 37^oC. Реакционную смесь (порциями по 50 мл с конц. 10 мг/мл) наносят на колонку с сефарозой 4B-Cl(100x5,5 см) в трис- HCl/NaCl буфере, pH 8,0, содержащем ЭДТА и NaN₃. В результате гель хроматографии получают очищенный Vi-антиген с выходом 4 мг с литра культуральной жидкости.

Нетоксичный, апирогенный продукт содержит менее 1% белка, 1-1,5% нуклеиновых кислот.

Пример 2. Микроорганизм Citrobacter freundii штамм 54/57 (коллекция Института вакцин и сывороток им И.И.Мечникова) культивируют на той же питательной среде, что и в примере 1. Обработку культуральной жидкости проводят аналогично описанному в примере 1.

Гель-хроматографию проводят с использованием Сефарозы 6B-Cl. Выход 3 мг/л питательной среды. Vi-антиген содержит менее 1% белка и 1-1,5% нуклеиновых кислот.

Пример 3. Культивирование S.typhi проводят как описано в примере 1. Выделение Vi-антигена осуществляют с использованием Сефадекса G-200. Выход антигена 3,5 мг/л культуральной жидкости. Содержание белка менее 1% нуктеиновых кислот 1-1,5%
Предлагаемый способ в отличие от известных предполагает максимальную полноту извлечения антигена из надклеточной жидкости, что обеспечивается хроматографическим разделением как окончательной стадией очистки препарата. Эта же процедура позволяет получить Vi-антиген с достаточно узким молекулярно-массовым распределением и максимально высокой молекулярной массой.

Литература
1. K.H.Wong and J.C.Feeley, Applied Microbiol. 24, N 4, 628-633.

2. F. M. Daniels, R.Schneerson, W.M.Egan, S.C.Szu, J.B.Robbins, Infect. Immun. 57, N 10, 3159-3164.

Изобретение относится к области инфекционной иммунологии, а именно к способу получения антигена бактериального происхождения и может быть использовано для создания препаратов, применяемых для иммунодиагностики и иммунопрофилактики брюшного тифа. Способ заключается в том, что микроорганизм Citrobacter freundii или Salmonella paratyphi культивируют на питательной среде, отделяют супернатант, стерилизуют микрофильтрацией, на мембранах с размером пор 0,22 мкм, фильтрат концентрируют, ультрацентрифугируют, обрабатывают ферментами, а затем подвергают гель-хроматографии. Предложенный способ технологичен и позволяет получать Vi-антиген хроматографического качества с высоким выходом и чистотой.

Способ получения Vi-антигена, включающий культивирование микроорганизма на питательной среде, отделение супернатанта с последующей очисткой антигена действием нуклеаз, отличающийся тем, что используют микроорганизм Citrobacter froundii или Salmonella tuphi, супернатант стерилизуют микрофильтрацией путем использования мембран с размером пор 0,22 мкм, фильтрат центрифугируют при 105000 g в течение 16 ч после обработки нуклеазами, проводят обработку проназой, а очистку антигена осуществляют на колонке с сефарозой 4В-CZ в трис•HCl буфере при pH 8,0.