ШТАММ БАКТЕРИЙ SHIGELLA SONNEI, ФАЗА 1, СТАБИЛЬНЫЙ ПРОДУЦЕНТ S-ЛИПОПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 A61K39/112 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения S-липополисахарида (ЛПС) Shigella sonnei, фаза 1, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов.

Нестабильность продукции О-антигена штаммами S. sonnei хорошо известна (Kopecko D.J., et.al., 1980; Hale T.L., et.al., 1983). Штаммы, растущие в лабораторных условиях, часто спонтанно переходят в R-форму бактерии, которая продуцирует R-ЛПС, не содержащий О-специфической полисахаридной цепи (Gamian A., Romanowska E., 1982). Отсутствие штамма, стабильно продуцирующего О-антиген, становится серьезным препятствием при разработке дизентерийной вакцины против шигелл Зонне. Ряд разработчиков был вынужден использовать вместо S. sonnei штамм Plesiomonas shigelloides, продуцирующий сходный серотип S-ЛПС (Taylor D.N. et.al., 1993).

Целью изобретения является штамм № 5063 S. sonnei, фаза 1, стабильно продуцирующий S-ЛПС.

Штамм S. sonnei № 5063 хранится в коллекции НИИВС им. И.И. Мечникова в 1970 году.

Морфологические признаки: неподвижные небольшие палочки, по Граму окрашиваются отрицательно.

Культуральные признаки: при выращивании на 1,5% мясопептонном агаре (рН 7,4) при температуре 36,5-37°С образует мелкие (2-2,5 мм в диаметре) преимущественно нежные полупрозрачные колонии с ровными краями (S-форма), могут встречаться и более плотные колонии с изрезанными краями (R-форма). При выращивании на бульоне Хоттингера (рН 7,4) при температуре 36,5-37°С в течение 16-20 часов дает интенсивное помутнение, пленку не образует.

Биохимические признаки:

- Разлагает глюкозу и мальтозу без образования газа.

- Медленно ферментирует лактозу и маннит.

- Не разжижает желатин.

- Не продуцирует сероводород.

- Не образует индол.

Серологические свойства: дает четкую положительную реакцию с типовой сывороткой Зонне. Положительно реагирует с сорбированой сывороткой I фазы и отрицательно - с сывороткой II фазы

Биологические свойства: штамм № 5063 обладает выраженной вирулентостью.

При введении в конъюнктивальный мешок морской свинки массой 200-250 г, вызывая гнойный кератоконъюнктивит с последующим помутнением роговицы, 100%-ная летальная доза (ЛД₁₀₀) - не более 10⁹ микробных клеток.

При внутрибрюшинном введении мышам в минимальном 0,4% полужидком агаре 50%-ная летальная доза (ЛД₅₀)не более 2×10⁸ микробных клеток.

При введении в легкие мышей молодой (16-часовой) бульонной культуры ЛД₅₀ не превышает 1,5-2×10⁵ микробных клеток.

При пассировании на мясопептонном агаре (длительность пассажа 18 часов, температура 37°С) и в мясопептонном бульоне (длительность пассажа 4 часа, температура 37°С) штамм стабильно сохраняет признаки S-формы, что отличает его от других штаммов S. sonnei (см. таблицу). Содержание колоний в R-форме через 3 пассажа не превышает 10%.

Штамм хранится в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4-10°С. Обязательный контроль всех свойств штамма проводят ежегодно.

Пример 1. Пассирование штамма № 5063 S. sonnei на плотной среде.

Ампулу с лиофилизированной культурой стерильно вскрывали и вносили в нее стерильный физиологический раствор. Каплю полученной суспензии клеток стерильной пипеткой переносили на чашку Петри с мясопептонным агаром и рассевали по всей поверхности чашки стерильным шпателем. Тем же шпателем делали посев еще на пять чашек с плотной питательной средой. Чашки помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С. По истечении 18 часов выбирали чашки с ростом бактерий в виде отдельных колоний. Количество S (прозрачных) и R (мутных) колоний определяли прямым подсчетом в проходящем свете. Для получения каждого следующего пассажа в проходящем свете отбирали S-колонии, суспендировали биомассу в стерильном физиологическом растворе и с помощью стерильного шпателя рассевали по поверхности чашек с плотной питательной средой.

Пример 2. Подготовка образцов для проведения ГЭФ.

18-часовую культуру смывали с агара фосфатным буфером (рН 7,2), добавляли азид натрия до концентрации его в смыве 0,01% и оставляли при 4-10°С на 3 часа. После этого культуру, убитую азидом натрия, разбавляли до оптической плотности, равной 0,4. Пробы по 1,5 мл помещали в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 1,5 минут. Надосадок удаляли, к осадку добавляли 50 мкл лизирующего буфера (2% додецилсульфата натрия, 4% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 1 М трис-HCl, рН 6,8). Образцы помещали в кипящую баню на 10 мин. После этого к каждому образцу лизата бактериальных клеток добавляли 10 мкл лизирующего буфера с 25 мкг протеиназы К (Sigma) и инкубировали 1 час при 60°С.

Пример 3. Проведение ГЭФ с последующим окрашиванием аммиачным раствором азотнокислого серебра.

ГЭФ изучаемых препаратов проводили на приборе для электрофореза фирмы BioRad (Швеция) в системе Laemli [Laemli U.K. Cleavage of strucrural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V.227. - P.680] в присутствии додецил-сульфата натрия. В работе использовали 3%-ный концентрирующий и 12,5%-ный разделяющий гели (толщина геля 0,8 мм). Объем образцов при нанесении составлял 5-10 мкл. Длина пробега образцов в разделяющем геле не превышала 15 см. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 15 мА, а в разделяющем - 30 мА. Окрашивание геля после проведения электрофореза осуществляли по методу Tsai [Tsai,C.-M., C.E. Frasch.E. Rivera,H.D. Hochstein. Measurements of lipopolysaccharide (endotoxin) in meningococcal protein and polysaccharide preparations for vaccine usage. // J. Biol. Stand. - 1989. - V.14. - P.25].

Сравнительный анализ картины ГЭФ наглядно показал, что ЛПС S. sonnei штамм № 5063, полученный из бактериальных клеток 10-ти пассажей, является типичным S-ЛПС, и количество звеньев его O-полисахаридной цепи (которое отражает количество дискретных зон в картине ГЭФ) не меняется в результате пассирования культуры.

Источники информации

Gamian A., Romanowka E.The core structure ofShigella sonnei lipopolysaccharide and the linkage between O-specific polysaccharide and the core region. Eur J Biochem 1982,129: 105-109.

Hale T.L., Guerry P., Seid R.C., Kapfer C., Wingfield M.E., Reaves C.B., Baron L.S.,

Formal S.B. Charchteriozation of virulence plasmids and plasmid asosiated outer membrane proteins in Shigella flexneri, Shigella sonnei, and Eshcerichia coli. Infect Immun 1984, 40:340-350.

Kopecko D.J., Washington O., Formal S.B. Genetic and phisical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect. Immun. 1980, 29:207-214.

Laemli.U.K. Cleavage of strucrural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature.l970. - V.227. - P.680.

Taylor DN, Trofa AC, SadoffJ, Chu C, Bryla D, Shiloach J, Cohen D, Ashkenazi S, Lerman Y, Egan W, Schneerson R, Robbins JB. Synthesis, characterization, and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids. Infect Immun. 1993 Sep;61(9):3678-87.

Tsai, C. - M.,C.E. Frasch.E. Rivera,H.D. Hochstein. Measurements of lipopolysaccharide (endotoxin) in meningococcal protein and polysaccharide preparations for vaccine usage. // J. Biol. Stand. - 1989. - V.14. - P.25.

Изобретение относится к области биотехнологии, а конкретнее - к штамму бактерий Shigella sonnei № 262 и может быть использовано для получения вакцинных и диагностических препаратов. Настоящий штамм обладает способностью стабильно продуцировать S-липополисахарид. 1 табл.

Штамм бактерий Shigella sonnei ГИСК им. Л.А.Тарасевича №262, фаза 1, стабильный продуцент S-липополисахарида.