ШТАММ БАКТЕРИЙ HAEMOPHILUS INFLUENZAE В №326, СТАБИЛЬНЫЙ ПРОДУЦЕНТ КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 A61K39/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения капсульного полисахарида, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов. Haemophilus influenzae b №326 (коллекция ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России №289) обладает способностью стабильно синтезировать капсульный полисахарид при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Капсульный полисахарид, продуцируемый Haemophilus influenzae b, является основой для производства специфических для данного серотипа возбудителя вакцин, а также диагностических тест-систем. С целью получения капсульного полисахарида разрабатывают системы культивирования микроорганизмов. Определяющим фактором эффективной системы культивирования является штамм-продуцент, способный стабильно синтезировать капсульный полисахарид в среду культивирования.

Для роста бактерий Haemophilus influenzae b требуются полноценные питательные среды. Однако при культивировании вакцинных штаммов следует избегать использования питательных сред, содержащих продукты животного происхождения, так как большое количество белков, содержащихся в полноценных питательных средах, мешает процессу очистки капсульного полисахарида [WHO Technical Report Series 897. WHO Expert committee on biological standardization. Forty-ninth Report. WHO, Geneva. 2000: 29-60]. С учетом рекомендаций ВОЗ оптимальными условиями культивирования вакцинных штаммов с целью получения чистых бактериальных полисахаридов следует считать синтетические и полусинтетические питательные среды.

Поскольку штаммы Haemophilus influenzae b обладают разными продуктивными и ростовыми характеристиками, целью изобретения является штамм Haemophilus influenzae b №326 (коллекция ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России №289), способный стабильно синтезировать капсульный полисахарид в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической средах.

Наиболее близким аналогом, с которым можно сравнивать предлагаемый штамм, является заявка на изобретение RU 2257412, 27.07.2005, С1 (Елкина С.И., Ястребова Н.Е., Орлова О.Е., Ванеева Н.П., Сергеев В.В., Апарин П.Г., Львов В.Л.: штамм Haemophilus influenzae b Mech №1 - продуцент капсульного полисахарида - полирибозилрибитолфосфата, в которой охарактеризованы культурально-морфологические, биохимические, антигенные свойства штамма Haemophilus influenzae b Mech №l, дана его продуктивность при росте на полусинтетической и синтетической питательных средах в количестве 50 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно по прошествии 6 часов от момента достижения стационарной фазы роста.

В отличие от аналога предлагаемый штамм Haemophilus influenzae b №326 (коллекция ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздравсоцразвития России №289) обладает рядом технических преимуществ: большая продуктивность от 80 до 130 мкг/мл на полусинтетической и от 90 до 150 мкг/мл на синтетической среде, высокая скорость роста на жидких питательных стерах (период культивирования по сравнению с аналогом короче почти в 2 раза).

Штамм Haemophilus influenzae b №326 выделен в 2006 году от больного ребенка в ходе клинико-лабораторного обследования (история болезни №62159) и характеризуется способностью стабильно синтезировать оптимальное количество капсульного полисахарида в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической средах. Культура идентифицирована по микробиологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Штамм Haemophilus influenzae b №326 принят на депонирование в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов III и IV групп «Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича» Минздравсоцразвития России под №289.

Морфологические свойства Haemophilus influenzae b №326. Микроскопия окрашенного мазка: грамотрицательные бактерии в форме прямых палочек с закругленными концами 0,5-2,0 мкм в длину и 0,2-0,3 мкм в ширину, имеют капсулу, обладают полиморфизмом.

Культуральные свойства Haemophilus influenzae b №326. На твердых питательных средах - образуют мелкие прозрачные колонии, которые похожи на капельки росы. На жидких питательных средах вызывают равномерное помутнение среды. Ростовыми факторами являются гемин и никотинамидаденонуклеотид (НАД). Оптимальные условия культивирования 35-37°С в атмосфере с повышенным содержанием CO₂(5-10%).

Биохимическая активность штамма Haemophilus influenzae b №326 - восстанавливает нитриты и нитраты, образует индол, ферментирует с образованием кислоты глюкозу и сахарозу, фруктозу, мальтозу, ксилозу.

Отношение штамма Haemophilus influenzae b №326 к видовым диагностическим сывороткам - относится к b серовару, с другими сыворотками не агглютинирует.

Антигенные свойства штамма Haemophilus influenzae b №326 - бактерии рода Haemophilus, вида Haemophilus influenza, серовариант b.

Штамм Haemophilus influenzae b №326 хранится в лиофилизированном состоянии в сахарозо-желатиновой среде (50% сахарозы, 50% желатины в физиологическом растворе).

Получение капсульного полисахарида при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах штамма Haemophilus influenzae b №326.

Пример №1. Выращивание штамма Haemophilus influenzae b №326 на синтетической питательной среде. В ампулу с лиофильно высушенной культурой вносили стерильный физиологический раствор. Каплю полученной суспензии рассевали на 1,5% сердечно-мозговой агар (Difco) с добавлением 10 мг/л гемина (HEMIN CLORIDE МР Biomedicals, LLC) и 4 мг/л среды НАД (NADH Dinatriumsalz AppliChem). Затем делали посев на чашки с плотной питательной средой. Чашки помещали в термостат на 18 часов при 37°С и 5-10% CO₂. Выросшую культуру подращивали в колбах емкостью 200 мл и пересевали в ферментер марки «Анкум» с жидкой синтетической питательной средой [Klein R.D., Luginbuhl G.H. Simplified media for growth of Haemophilus influenzae from clinical and normal flora sources. J. Gen. Microbiol. 1970, 113: 409-411], содержащую кроме солей факторы роста (гемин, НАД). Выращивание проводили в условиях принудительной аэрации при 37°С. В процессе культивирования биомассу равномерно перемешивали. Пробы для определения количества накапливающегося в питательной среде капсульного полисахарида отбирали каждый час. После достижения стационарной фазы выращивание заканчивали. Длительность культивирования не превышала 8 часов. Количество капсульного полисахарида в среде культивирования оценивали по результатам ракетного иммунноэлектрофореза (РИЭФ). В качестве референс-препарата использовали очищенный капсульный полисахарид. Количество капсульного полисахарида, выделяемого при глубинном культивировании, составляло от 90 до 150 мкг/мл культуральной жидкости.

Пример №2. Выращивание штамма Haemophilis influenzae b №326 в полу синтетической питательной среде. Посевную культуру готовили аналогично выше описанному способу. Внесение посевного материала проводили в питательную среду, содержащую раствор солей [Klein R.D., Luginbuhl G.H. Simplified media for growth of Haemophilus influenzae from clinical and normal flora sources. J. Gen. Microbiol. 1970, 113: 409-411], факторы роста (гемин, НАД), казеиновый пептон (PEPTON from CASEIN, AppliChem) 20 гр на литр, глюкозу 2 гр на литр. Выращивание проходило при тех же технических условиях. Количество капсульного полисахарида, выделяемого при глубинном культивировании штамма на полусинтетической питательной среде, составляло от 80 до 130 мкг/мл культуральной жидкости.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Anderson P., Pitt J., Smith D.H. Synthesis and release of polyribophosphate by Haemophilus influenzae b in vitro. Infect. Immun. 1976, Feb. 581-589.

2. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М., «Наука», 1983, 139-143.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Haemophilus influenzae b №326 (коллекция ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России №289), который обладает способностью стабильно синтезировать капсульный полисахарид в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах, характеризуется высокой продуктивностью (от 90 до 150 мкг/мл на синтетической и от 80 до 130 мкг/мл на полусинтетической среде) при минимальном периоде культивирования. Изобретение может быть использовано для получения капсульного полисахарида, пригодного для создания вакцинных и диагностических препаратов. 2 пр.

Штамм Haemophilus influenzae b №326, депонированный в коллекции ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России под №289, стабильный продуцент капсульного полисахарида в среду культивирования при росте на синтетической и полусинтетической питательных средах.