СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ БАКТЕРИЙ ВИДА PASTEURELLA MULTOCIDA Российский патент 1997 года по МПК A61K39/40 C12N1/20 A61K39/40 A61K39/102 A61K39/395 

Изобретение относится к способам получения гипериммунных сывороток против бактерии Pasteurella multocida, используемых для лечения животных.

Известны способы получения сывороток путем гипериммунизации животных, например телят с использованием в качестве антигенов культуры штаммов P.multocida, выделенных от крупного рогатого скота, буйволов, овец и свиней, погибших от пастереллеза (инструкция по изготовлению и контролю сыворотки против пастереллеза крупного рогатого скота, буйволов, овец и свиней. Утв. Главветупром МСХ СССР 18 июня 1970).

Наиболее близким техническим решением является способ получения гипериммунной сыворотки против Р.multocida путем иммунизации животных антигеном из культуры R.multocida серологических вариантов А, В и Д (Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота, М. автороферат док. дисс. 1993).

Недостатком способа является проведение гипериммунизации без должного учета этиологических факторов развития респираторной патологии. Так серологический вариант В не играет роль в развитии респираторной патологии, а использование его для гипериммунизации ведет к излишнему напряжению иммунной системы организма и не способствует оптимальному накапливанию антител в организме гипериммунизируемых животных. Кроме того, сыворотка недостаточно эффективна при смешанных респираторных инфекциях молодняка крупного рогатого скота.

Отличительной особенностью предложенного способа является то, что для гипериммунизации животных в качестве антигенов используют культуры Р.multocida серологических вариантов А (штамм 81-А/и Д /штамм 81-Д), выделенные от больных телят с характерными признаками поражения респираторных органов. Штаммы, впервые, выделены и депонированы в коллекции Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов (справки о депонировании штаммов).

Серологические варианты А и Д изолирует, как правило, от животных с заболеваниями органов дыхания, причем им отводится второстепенная роль в развитии болезни (Геведзе В. И. 1989). Проведенные исследования позволили получить сыворотку, высокоэффективную при смешанных респираторных инфекциях молодняка крупного рогатого скота, с использованием в качестве антигена штаммов Р.multocida, принадлежащих именно к этим серологическим вариантам.

Сущность предложенного способа получения сыворотки против P.multocida состоит в следующем.

Берут соответствующие требованиям штаммы P.multocida серовариантов А (штамм 81-А) и Д (штамм 81-Д), готовят антиген путем раздельного их выращивания на мясопептонном бульоне, смешивают, инактивируют, если это необходимо, добавляют 4%-ный раствор алюминиевых квасцов, а после отстаивания надосадочную жидкость используют в качестве антигена, который вводят в возрастающих дозах семикратно с интервалом 3 дня, затем гипериммунную сыворотку получают из цитрированной крови продуцентов путем сепарирования и отделения от плазмы, после чего сыворотку используют с лечебной и профилактической целью при острых распираторных заболеваниях телят инфекционной природы.

Пример. Предложенный способ получения сыворотки осуществлен и испытан в условиях колхоза "Большевик" Белгородской области. В этом хозяйстве откармливают телят с 20-дневного возраста. Комплектование стада осуществляют из 40 хозяйств-поставщиков. В первые дни после поступления телят в откормочное хозяйство у них наблюдается респираторная патология. При изучении этиопатогенеза этой патологии установлено этиологическое значение патерелл серотипов А и Д, стрептококков группы В и С, а также вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-З, аденовирусов и вирусной диареи, то есть причиной возникновения массовых распираторных инфекций были микроорганизмы на различных таксономических групп, действующие на фоне различных стрессовых факторов. В современной литературе такие патологии принято называть ассоциированными или смешанными инфекциями. В связи с этим в данной заявке при анализе эффективности cыворотки (полученной предложенным способом) использован термин "смешанная инфекция".

В качестве антигенов использовали культуры P.multocida серологических вариантов А (штамм 81-А) и Д (штамм 81-Д), соответствующие по своим культуральным, биохимическим и вирулентным свойствам требованиям, предъявляемым к подобного рода штаммам.

Культуры пастерелл указанных штаммов выращивали раздельно на мясопептонном бульоне, в термостате при 37^oC в течение 18 24 ч, выросшие культуры проверяли на типичность и интенсивность роста, изучали морфологию пастерелл в мазках после окраски по Грамму.

Для изготовления инактивированного преципитированного антигена готовили смесь двух серовариантов пастерелл в соотношении 1:1, которую инъактивируют прогреванием в водяной бане при 60^o в течение 30 мин. Затем ее проверяли на стерильность путем высева 0,1 мл культуры на кровяной агар и проращивания в термостате при 37^o в течение 24 ч. В инактивированную смесь добавили 4 раствор алюминиевых квасцов из расчета 5 мл раствора квасцов на 95 мл смешанной культуры пастерелл, после перемешивания отстаивали в холодильнике в течение 24 ч, декантировали 35 надосадочной жидкости, от общего объема.

Для изготовления живого преципитированного антигена исключали этап инактивирования пастерелл.

В качестве продуцентов использовали здоровых, имеющих удовлетворительную упитанность волов, в возрасте 4 8 лет и живой массой 350-400 кг.

Гипериммунизацию проводили в возрастающих дозах подкожно в область шеи с интервалом 3 дня инактивированным антигеном (10, 20 и 30 мл), затем живым антигеном (5, 10, 40 и 60 мл). После окончания цикла иммунизации у животных после голодания 16 18 ч взяли кровь из яремной вены из расчета 1,5 л на 100 кг массы. Гипериммунную сыворотку получали из цитрированной крови продуцентов с последующим ее сепарированием от плазмы. Для цитрирования крови применяли 10 раствор лимонно-кислого натрия из расчета 30 31 мл/л крови. Кровь отстаивали в стерильных полиэтиленовых мешках. После сепарирования и дефибринирования добавляли консервант 0,5%-ный раствор фенола из расчета 100 мл на 900 мл сыворотки, стерилизовали и расфасовывали.

Гипериммунная сыворотка имела титры антител: в реакции диффузионной преципитации против сероварианта А штамма 81-А 1:8-1:32, сероварианта Д штамма 81-Д 1:16-1:32, в пробе роста против сероварианта А 1:32-1:64, Д 1:32-1:128.

Лечебную эффективность полученной сыворотки определяли, сравнивая ее с лечебной эффективностью биофабричной противопастереллезной сыворотки и сыворотки, полученной по способу-прототипу (Шегидевич Э.А. 1993, с.43).

Полученную сыворотку ввели 50 больным телятам с ярковыраженными клиническими симптомами острого респираторного синдрома подножно и аэрозольно в дозе 1 мл/кг массы и 4 мл на 1 м камеры соответственно. Из 50 больных животных выздоровело 48, то есть 90 пало 2, т.е. 4 Это значительно повышало эффективность биофабричной сыворотки, где из 60 голов выздоровело 41 68,3 пало 19 31,7 и было выше максимальной лечебной эффективности сыворотки, полученной по способу-прототипу, приведенной ее автором в своей докторской диссертации, а именно: из 36 больных телят выздоровело 34 94,5 пало 2 -5,5
Таким образом, предложенный способ получения сыворотки против P.multocida позволяет получить гипериммунную сыворотку, обладающую выраженной лечебной эффективностью при смешанных распираторных инфекциях молодняка крупного рогатого скота с использованием только таких серовариантов культуры P. multocida, чья этиологическая роль в развитии заболевания считалась второстепенной. Следовательно гипериммунизация проходит при щадящем воздействии на иммунную систему организма животных, что обеспечивает оптимальное накопление антител в их крови. При этом сыворотку готовят из производственных штаммов, хранящихся в коллекции Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов.

Использование: биотехнология, сыворотка против Pasteurella multocida, пастереллез. Сущность изобретения: способ основан на использовании для гипериммунизации культур пастерелл серотипов А и Д: штамма Pasteurella multorida ВГНКИ N 81-А-ДЕП и штамма Pasteurella multocida ВГНКИ N 81-Д-ДЕП. Способ обеспечивает получение сыворотки, обладающей высокой лечебной эффективностью при смешанных респираторных инфекциях молодняка крупного рогатого скота.

Способ получения сыворотки против бактерий вида Pasteurella multocida, включающий изготовление антигенов, гипериммунизацию волов-продуцентов, взятие и обработку крови с последующим выделением и стерилизацией сыворотки, отличающийся тем, что для гипериммунизации животных в качестве антигенов используют культуры пастерелл серологического варианта А штамм Pasteurella multocida ВГНКИ N 81-А-ДЕП и серологического варианта Д штамм Pasteurella multocida ВГНКИ N 81-Д-ДЕП.