СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/102 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики, в частности для получения вакцины против пастереллеза животных.

Известен способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования пастерелл в жидкой питательной среде, исследование физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированном их и инактивацией формалином (Патент РФ №2246316, Бюл. №5, опубл. 20.02.2005, МКИ⁷ А61К 39/02). Известный способ получения вакцины против пастереллеза животных основан на технологии выращивания пастерелл (P.multocida сероварианты А, В, D, штаммы №1231, 681, Т-80) при производстве противопастереллезных вакцин, включающий определение и установление рН, типичности и чистоты роста производственных штаммов, концентрации микробных клеток в культуре, обеспечивающий получение стандартизованных по количеству микробных клеток в препарате. В соответствии с разработанной технологией выращивания производственное глубинное культивирование пастерелл проводят обычно до 12-14 часов, достигая при этом максимального числа клеток, находящихся в культуре во время стационарной фазы роста. Культивирование прекращают тогда, когда концентрация микробов перестает увеличиваться. Обычно производственную противопастереллезную вакцину готовят с высокой концентрацией бактериальных клеток с оптической плотностью до 25 млрд м.кл./см³ пастерелл каждого штамма и которая в большинстве случаев реактогенна.

Недостатком известного способа является низкое качество целевого продукта, выявляемое в низкой иммуногенности.

Известен также способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования P.multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде, исследования физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированием их и инактивацией формалином, отличающийся тем, что дополнительно определяют в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы, активность растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации, а прекращение культивирования пастерелл осуществляют при ее значении для P.multocida серологических вариантов А, В, D как 1:512-1024, 1:1024-2048, 1:1024-2048 соответственно, при этом целевой продукт получают концентрированием в 3-5 раз культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы (патент РФ №2310473, БИ №27, 2007).

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его иммуногенной активности.

Поставленная задача решается в способе получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования P.multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде, определения в культуральной жидкости активности растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл концентрированием их и инактивацией формалином тем, что дополнительно культивируют Pasteurella haemolytica, инактивированную бактериальную массу центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см³ с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, далее реакционную среду центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант, а целевой продукт получают добавлением к супернатанту формалина в конечной концентрации 0,12-0,15%.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения вакцины против пастереллезов животных, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые предложен способ получения вакцины против пастереллезов животных путем культивирования Р.multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica в жидкой питательной среде. Также впервые разработаны режимы получения вакцины против пастереллеза животных, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта и ускорение способа, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастереллеза крупного рогатого скота и овец.

Для этого отобраны производственные штаммы: Р.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 10 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:1024 и 1:8 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см³ с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, далее реакционную среду центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант.

Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096, 1:5120, 1:5120 и 1:32 соответственно, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,12-0,15% и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 12 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:12).

Пример 2.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастереллеза крупного рогатого скота и овец.

Для этого отобраны три производственных штамма Р.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 8 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024, 1:512 и 1:16 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см³ с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, далее реакционную среду центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант.

Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 3 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:2048, 1:4096, 1:2048 и 1:64 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 11 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:11).

Пример 3.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастереллеза крупного рогатого скота и овец.

Для этого отобраны три производственных штамма Р.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 11% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 36°C в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 9 часов культивирования был равен 1:1024; 1:1024 и 1:2048 и 1:16 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 4 раза, после чего концентраты исследуют в РИГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096; 1:4096, 1:8192 и 1:64 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 10 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:10).

Пример 4.

Получают эмульгированную вакцину против пастереллеза свиней.

Для этого отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 12% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 38°C в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 10 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:1024 и 1:8 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 38°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РИГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов P.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096; 1:5120; 1:5120 и 1:16 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 10 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:10).

Пример 5.

Получают эмульгированную вакцину против пастереллеза свиней.

Для этого отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 8 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:512 и 1:32 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученную культуральную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:2048; 1:4096; 1:2048 и 1:64 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 11 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:11).

Пример 6.

Получают эмульгированную вакцину против пастереллеза свиней.

Для этого отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 8% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 36°C в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 9 часов культивирования был равен 1:1024; 1:1024; 1:2048 и 1:8 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 36°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 4 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов P.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096; 1:4096; 1:8192 и 1:32 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 10 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:10).

Иммунологическую активность полученных вакцин согласно примерам 1-3 сравнивали с иммунологической активностью известного технического решения по результатам заражения мышей смертельной дозой смесью вирулентных штаммов P.multocida сероварианта A, P.multocida сероварианта В, P.multocida сероварианта D и Pasteurella haemolytica через 28 дней после двухкратной иммунизации мышей опытной вакциной и известной. Полученные опыты показали, что после заражения мышей смертельной дозой смесью вирулентных штаммов P.multocida сероварианта A, P.multocida сероварианта В, P.multocida сероварианта D и Pasteurella haemolytica через 28 дней после их двухкратной иммунизации в опытных группах в живых сохранилось 50-60% мышей, в то время как в контрольной группе мышей, вакцинированной известной вакциной, пало 100% животных.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемая вакцина против пастереллеза животных позволяет повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 2 раза, а также в 1,5 раза увеличить сроки хранения целевого продукта.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ включает культивирования Pasteurella multocida серологических вариантов A, В, D и Pasteurella haemolytica в жидкой питательной среде. При этом каждый штамм отдельно засевают из расчета 10% к объему питательной среды и культивируют при температуре 37°C до максимального уровня накопления растворимых поверхностных антигенов в среде роста. Полученную бактериальную массу инактивируют формалином в течение 24 часов при температуре 37°C±1°C до конечной концентрации формалина 0,3%. Затем инактивированную бактериальную массу каждого штамма смешивают в равных соотношениях, центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см³ с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C. Центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант, который затем концентрируют в 3-5 раз. Определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации и при активности поверхностных растворимых антигенов Pasteurella multocida серологических вариантов A, В, D и Pasteurella haemolytica соответственно 1:2048-4096, 1:4096-5120, 1:2048-8192 и 1:16-64 получают вакцину. Способ позволяет ускорить процесс получения вакцины и повысить ее активность.

Способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что дополнительно культивируют Pasteurella haemolytica, при этом каждый штамм отдельно засевают из расчета 10% к объему питательной среды и культивируют при температуре 37°C до максимального уровня накопления растворимых поверхностных антигенов в среде роста, полученную бактериальную массу инактивируют формалином в течение 24 ч при температуре 37±1°C до конечной концентрации формалина 0,3%, после чего инактивированную бактериальную массу каждого штамма смешивают в равных соотношениях, центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см³ с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант, который затем концентрируют в 3-5 раз, определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации, и при активности поверхностных растворимых антигенов Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica соответственно 1:2048-4096, 1:4096-5120, 1:2048-8192 и 1:16-64 получают вакцину.