Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к новым микробиологическим способам гидроксилирования метильных групп в ароматических 5- или 6-членных гетероциклах, а также к используемым новым гибридным плазмидам и новым продуцируемым штаммам.
Эти гидроксиметилированные гетероциклы являются важными промежуточными продуктами для получения фармацевтических препаратов и агрохимикалиев.
Микробиологический способ терминального гидроксилирования алифатических боковых цепей с помощью микроорганизмов полученных методом генетической инжнерии известен из европейского патента А-0 277 674. Эта реакция катализируется алкангидроксилазой, которая кодируется геном alkBA из OCT - плазмиды Pseudomonas oleovorans.
Эти микроорганизмы генетически так изменены, что они не способны окислять образующиеся гидроксильные группы до кислоты. Однако у них сохраняется естественная экспрессия и регуляция (alkR) этого гена. Эти микроорганизмы не способны окислять метильные группы в гетероциклах, но катализируют гидроксилирование алканов и алкилированных соединений с алкильными остатками с 6 12 C-атомами.
Далее из Harayama et al. J.Bacteriol. 171 (1989), с. 5048 5055 известно, что микроорганизмы вида Pseudomonas с помощью плазмиды pWWO могут в три стадии окислять метильную группу толуола до бензойной кислоты. В результате воздействия ксилолмонооксигеназы (xylMA) вначале образуется бензиловый спирт, который затем в следующих стадиях, при катализе спиртовой (xylB) а альдегидной (xylC) дегидрогеназой, переводится в кислоту.
В этом штамме имеются как xyl-гены, которые кодируют ферменты разрушения ксилола, а также и гены, которые ответственны за регуляцию xyl-генов на плазмиде pWWO.
Известны рестрикционные карты ответственных за окисление метильной группы генов xylMABCN. Функция гена xylN еще неизвестна. Неизвестен микробиологический способ, который позволяет гидроксилировать метильные группы в ароматических 5- или 6-членных гетероциклах.
Технический результат изобретения разработка микробиологического способа специфического гидроксилирования метильных групп в ароматических 5- или 6-членных гетероциклах до соответствующих чистых оксиметилированных производных, которые далее не катаболизируются.
Согласно изобретению способ осуществляется с помощью микроорганизмов, которые:
а) содержат гены плазмиды Pseudomonas TOL, образующие активную ксилолмонооксигеназу;
б) не образуют никакой активной спиртовой дегидрогеназы, которая кодируется плазмидой или хромосомой, и, таким образом, способны гидроксилировать метильные группы ароматических 5- и 6-членных гетероциклов до соответствующего оксиметильного производного, причем гетероцикл служит в качестве субстрата для превращения и не имеет никаких заместителей на соседнем к гидроксилируемой метильной группе атоме углерода и оксиметильное производное далее не катаболизируется.
Согласно изобретению микроорганизмы содержат гены для образования ксилолмонооксигеназы Psecdomonas TOL плазмиды pWWO, которые характеризуются рестрикционной картой (см. чертеж) и уже описаны в J.Bacteriol. 171 (1989), с. 5048 5055.
Источник гена ксилолмонооксигеназы.
В качестве источника гена ксилолмонооксигеназы можно применять Pseudomonas putida с TOL плазмидой pWWO, который, например, может представлять собой ATCC 33015 в Американской коллекции типовых культур.
Генетическую информацию, кодирующую ксилолмонооксигеназу, получают благодаря тому, что TOL-плазмидную ДНК выделяют из этого микроорганизма. Затем эту TOL-плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами для выделения гена ксилолмонооксигеназы и специфическую последовательность гена затем вводят в вектор экспрессии. Благодаря этому образуется гибридная плазмида, которую затем можно встраивать в пригодный для способа микроорганизм (штамм-хозяин) с помощью трансформации. Этот трансформированный штамм-хозяин затем образует штамм продуцент (после селекции) для предлагаемого в изобретении способа ферментации.
Выделение TOL-плазмидной ДНК.
TOL-плазмидную ДНК можно получать с помощью обычных для специалиста способов, как, например, по способу Hansen и Olsen (J. Bacteriol. 135, 1978, с. 227 238) или Humphreys et al. (Biochim. Biophys. Acta, 383, 1975, с. 457 483). Целесообразно для выделения больших количеств TOL-плазмидной ДНК применять метод Humphreys et al. (Biochim. Biophys. Acta 383, 1975, с. 457 - 483), который состоит в том, что Pseudomonas putida (ATCC-33015) полностью лuзируют и затем с помощью центрифугирования в градиенте плотности выделяют TOL-плазмиду.
Расщепление с помощью рестрикционных ферментов и выделение ДНК благодаря гель-электрофорезу на агарозе.
После выделения TOL-плазмидной ДНК ее расщепляют с помощью рестрикционных ферментов Sal I и Hind III, затем отрезок ДНК, кодирующий ксилоломонооксигеназу, выделяют с помощью гель-электрофореза на агарозе, согласно Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons. Нью-Йорк, 1987, раздел 2.6 "Isolation and Purification of Large DNA - Restriction Framents from Agarose Gels". Этот отрезок ДНК, как уже было сказано выше, характеризуется рестрикционной картой и не содержит никаких генов, которые кодируют активную спиртовую дегидрогеназу (см. чертеж).
Легирование отрезка ДНК в вектор экспрессии.
Таким образом, полученный отрезок гена можно лигировать с помощью обычных молекулярно-биологических способов вектором экспрессии ДНК, который предварительно обработали рестриктазами до гибридной плазмиды.
Векторы экспрессии обычно содержат пригодный, чаще всего регулируемый, промотор. За этим промотором в направлении транскрипции находятся один или несколько сайтов рестрикции для встраивания чужеродных фрагментов. В эти сайты рестрикции обычно встраивают необходимый фрагмент гена, в экспрессии которого заинтересованы.
Целесообразно в качестве векторов экспрессии применять векторы, которые указаны в табл. 1. В частности, применяются векторы экспрессии с широким спектром хозяев (broad host range), как pME285, pKT240, pMMB67EH или pMM67EN*.
Эти векторы экспрессии обрабатывают рестриктазами Sal I и Hind III.
Образующийся изолированный фрагмент TOL-плазмидной ДНК лигируют с помощью, например, T4-ДНК-лигазы. В случае необходимости также можно применять другие методы легирования, как, например, те, которые описаны в "Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1989, раздел 3.16 "Subcloning of DNA-fragments".
Гибридные плазмиды.
Образовавшиеся гибридные плазмиды pLO3, pLO4 и pLO5, также являющиеся составной частью изобретения, обладают широким спектром хозяев и соответственно этому могут использоваться в штаммах-хозяевах с высокой субстратной и аддуктной толерантностью.
Соответственно этому гибридная плазмида pLO4 (состоящая из вектора экспрессии pMMB67EH и TOL-плазмидой ДНК гена, характеризующегося ранее описанной рестрикционной картой), с промотором Ptac содержит ген-репрессор laclg. При этом экспрессия TOL-плазмидных генов индуцируется изопропилтиогалактозидом (IPTG).
Экспрессия TOL-плазмидных генов в гибридной плазмиде pLO5 (состоящей из вектора экспрессии pMMB67EH* и TOL-плазмидного гена, характеризующегося рестрикционной картой (см. чертеж), с промотором Ptac, индуцируется конститутивно (ген-репрессор laclq отсутствует).
Благодаря введению гена канамицин резистентности репрессор laclq мутирует в pMMB67EH*.
Кроме того, можно применять гибридную плазмиду с более узким спектром хозяев. В качестве гибридной плазмиды с более узким спектром хозяев применяют pGSH2836 с промотором лямбда PL, причем экспрессия TOL-плазмида-генов индуцируется перманентно (конститутивно). Если, например, в качестве хозяина для pGSH2836 служит Escherichia coli (E. coli) K12, то благодаря температуре должен инактивироваться интегрированный туда хромосомально ген-экспрессор c1857, чтобы достичь экспрессии промотора лямбда PL.
Гибридная плазмида pGSH2836 депонирована в E.coli K12* под номером DSM 6154 в "Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH". Mascheroderweg 1b, D-3300 Брауншвейг. Гибридные плазмиды pLO4 и pLO5 депонированы, как описывается в следующих разделах, в E.coli K12* (pLO4) или в Pseudomonas putida (pLO5).
Штаммы-хозяева.
Образовавшиеся гибридные плазмиды (pLO3, pLO4, pLO5) могут переноситься в множество штаммов-хозяев.
При этом спользуются штаммы-хозяева с высокой субстратной и аддуктной толерантностью, такие как, например, как штаммы-хозяева рода Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium или Escherichia.
Трансформация.
Введение гибридных плазмид в ранее описанные штаммы-хозяева можно осуществлять обычными способами, предпочтительно методом Lederberg и Cohen (J. Bacteriol. 119, 1974, с. 1072-1074).
Продуцирующие штаммы.
В качестве продуцирующих, целесообразно применять штаммы, перечисленные в табл. 2. Микроорганизмы, трансформированные с помощью гибридных плазмид pLo3, pLo4 и pLO5 (табл. 2), являются новыми и, таким образом, также составляют часть изобретения.
Предпочтительно применяется штамм микроорганизма E.coli K12*, трансформированный с помощью гибридной плазмиды pLO4, депонированный 29.08.1990 под номером DSM 6153, или штамм микроорганизма Pseudomonas pctida JD7, трансформированный с помощью гибридной плазмиды pLO5, депонированной 29.08.1990 под номером DSM 6152, а также их потомки и мутанты.
Депонирование осуществлено в Deutschep Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Брауншвейг.
В качестве продуцирующих штаммов можно также использовать такие микроорганизмы, которые содержат природную TOL-плазмиду и при условии, что ген, который кодирует активную спиртовую дегидрогеназу, у них удален или инактивирован. Инактивацию или удаление можно осуществлять путем классической мутации, например, с помощью акридинового оранжевого через инсерцию транспозона или благодаря нижеуказанному методу "замены генов" с помощью гомологичной рекомбинации (A.Zimmermann et al, Molecular Microbiology 5, 1991, с. 1483-1490).
В таких штаммах происходит экспрессия TOL-плазмидного гена, например, путем индукции такими соединениями, как толуол, ксилол или цимол.
Удаление гена спиртовой дегидрогеназы можно осуществлять так, что ранее приготовленная вспомогательная гибридная плазмида, из которой уже удален ген спиртовой дегидрогеназы, с помощью гомологичной рекомбинации вводится в природную TOL-плазмиду ("замена гена" гомологичной рекомбинацией). Благодаря этому удаляется ген спиртовой дегидрогеназы из природной TOL-плазмиды.
Селекция трансформированных микроорганизмов (продуцирующие штаммы).
Обычно можно осуществлять селекцию трансформантов на минимальном количестве среды глюкоза-агар с соответствующей концентрацией пригодного антибиотика. Применяемые марки антибиотиков указаны в табл. 1.
Способ ферментации.
Согласно изобретению полученные по ранее описанному способу продутирующие штаммы, а также их потомки и мутанты используются для предлагаемого в изобретении способа гидроксилирования метильных групп в ароматических 5- или 6-членных гетероциклах.
В качестве субстратов для превращения можно применять метилированные ароматические 5- или 6-членные гетероциклы, которые содержат один или несколько гетероатомов из ряда, включающего кислород, азот, серу.
Пригодными 5-членными гетероциклами являются, например, метилированные производные тиофена, фурана, пиррола, тиазола, пиразола и имидазола, которые не содержат никаких заместителей у соседнего к гидроксилируемой группе атома углерода. Предпочтительно в качестве 5-членных гетероциклов применяют 3,5-диметилпиразол, 4-метилтиазол и 2,5-диметилтиофен.
Пригодными 6-членными гетероциклами являются, например, метилированные производные пиридина, пиримидина, пиразина и пиридазина, которые не содержат никаких заместителей у соседнего к гидроксилируемой метильной группе атома углерода. Предпочтительно в качестве 6-членных гетероциклов применяют 2-хлор-5-метилпиридин, 2,5-диметилпиразин и 2,6-диметилпиримидин.
Перед добавкой субстрата клетки выращивают в культуральной среде вплоть до оптимальной плотности при 650 нм (OD650) 1-200, предпочтительно вплоть до оптимальной плотности 5-100.
Превращение можно осуществлять либо при одноразовой, либо непрерывной добавке субстрата так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала 20% (вес/объем) для жидких субстратов. Предпочтительно добавление субстрата осуществляют так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала 5% (вес/объем).
Превращение обычно осуществляется с находящимися в покое клетками в pH-области 4 11, (предпочтительно 6 10), при 15 50oC (предпочтительно 25 45oC).
После превращения соответствующие оксиметильные производные можно выделять известным способом.
Пример 1. Клонирование генов XyIMA.
1.1. Приготовление плазмиды (Humphreys et al. Biochim. Biophys. Acta 383 (1975), с. 457 483).
Из 1 л выращенной бактериальной культуры Pseudomonas pulida pWWO (ATCC 33015) клетки отделяют на центрифуге. После повторного суспендирования в 10 мл 25% -ной сахарозы, в 0,05 М Трис-буфере, pH 8, добавляют 1,5 мл раствора лизоцима (20 мг, мл в 0,25 М Трис-буфере, PH 8,0). Затем проводят инкубацию в течении 5 минут на льду. Добавляют 10 мл 0,25 М Na2ЭДТА (pH 8) и проводят дальнейшую инкубацию в течение 5 мин на льду.
Затем добавляют 15 мл Brij® -раствора простого полиэксиленлаурилового эфира/DCL(1% Brij® 58,04% деоксихолята натрия в 0,01 М Трис-буфере, 0,001 М Na2 ЭДТА, pH 8,0). При равномерном перемешивании осуществляют инкубацию на льду в течение 30 мин вплоть до полного лизирования клеток.
После центрифугирования в течение 45 мин при 4oC и 16000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют в термостатируемом мерном цилиндре. После этого добавляют 3% (вес, объем) NaCl и 10% ПЭГ (полиэтиленгликоль). Благодаря осторожному поворачиванию закрытого парафиновой пленкой цилиндра получают раствор. Инкубируют в течение 2 ч при 4oC. Центрифугируют 2 мин при 5000 об/мин. Затем декантируют недостаточную жидкость и растворяют осадок в 5 мл TES-буфера (0,05 М Трис, 0,005 М Na2 ЭДТА, 0,05 М NaCl, pH 8,0), переводят в термостатируемую емкость 15 мл Comex-пробирку с 8,0 г хлорида кальция. После добавления 0,6 мл раствора этидийбромида (10 мг/мл) инкубируют 30 мин на льду. Центрифугируют 30 мин при 4oC при 12000 об/мин. Затем осторожно декантируют для удаления осадившегося ПЭГ из раствора. Осуществляют ультрацентрифугирование раствора в закрытых пробирках с 50TI-ротором при 40000 об/мин в течение 30 ч при 18oC. После этого выделяют плазмидные полосы из CsC2 градиентов с помощью канюли перед УФ-трансиллюминатором. Удаляют этидийбромид из плазмидного препарата путем встряхивания с н-бутанолом. Затем осаждают изопропанолом плазмидную ДНК и высушивают осадок в Speed Vac® Concentrator. Снова суспендируют плазмидный препарат в 0,01 М Трис-буфере, 0,001 М Na2 ЭДТА, pH 8,0.
1.2. Выделение фрагментов xylMA из агарозных гелей.
Обработанную с помощью SalI и HindIII (смотря по обстоятельствам, 4 ед. на мкг плазмидной ДНК) плазмидную ДНК подвергают препаративному агарозо-гельэлектрофорезу [0,6% (вес/объем) агарозы, в TBE-буфере (0,09 М Трис-бората, 2,5 мМ Na2 ЭДТА, pH 8,3, этидийбромид (100 мкг/100 мл)]
Разрезанную на мелкие полосы мембрану из DEAE-целлюлозы помещают в воду и в разрезы в агарозогеле помещают полосы фрагментов ДНК. ДНК наращивают на мембрану в поле напряжения. В случае необходимости ДНК фрагменты большего размера удерживаются другой мембраной. Нагруженную ДНК смывают с мембраны с помощью 500 мкл элюирующего буфера (20 мМ Трис, pH 7,5, 1 мМ Na2 ЭДТА, 1,5 М NaCl) в течение 1 ч при 65oC.
Мембрану удаляют и споласкивают. Этидийбромид экстрагируют насыщенным водной н-бутанолом из раствора ДНК, ДНК осаждают изопропанолом. Высушивают осадок в Speed Vac® Concentrator. Снова суспендируют препарат фрагмента в 0,01 М Трис-буфере, 0,001 М Na2 ЭДТА, pH 8,0.
1.3. Лигирование ДНК-фрагментов xylMA в векторы экспрессии
(Current Protocols in Molecular Biology. John Wileu and Sons. Нью-Йорк (1989), раздел 3.16 "Subcloning of DNA-fragments").
а) Приготовление гибридной плазмиды rLO4.
Предварительное приготовление вектора экспрессии ДНК
Перед легированием pMMB67EH-векторную ДНК (2 мкг) обрабатывают 10 ед. SalI и 10 ед. HindIII в соответствующем буфере для легирования (20 ммоль Трис-буфера, 10 ммоль DTT (дитиоэритритол), 10 ммоль MgCl2, 0,6 ммоль ATP, pH 7,2).
Обработанную ДНК затем дефосфорилируют с помощью 4,8 ед. щелочной фосфатазы. ДНК повторно осаждают изопропанолом и промывают.
Лигирование xylMA ДНК векторами экспрессии ДНК.
Для легирования соответствующие ДНК пробы объединяют вместе (в различных количественных соотношениях при избытке ДНК вставки), подвергают осаждению изопропанолом и высушенные осадки растворяют в 40 100 мкл буфера для легирования (20 ммоль Трис-буфер, 10 ммоль DTT, 10 ммоль MgCl2, 0,6 ммоль АТР, pH 7,2). Легирование осуществляют после добавления 0,2 ед. Т4-ДНК-лигазы на мкг ДНК в течение ночи при инкубировании при 12 16oC.
Затем легированную смесь используют для трансформации.
б) Приготовление гибридной плазмиды pLO5.
Аналогично примеру 1.3а приготавливают вектор экспресси pMMB67EH* и затем, как и в 1.3а, лигируют xylMA гены в этом векторе.
1.4. Трансформация компонентных клеток с помощью гибридной плазмидной ДНК (pLO4)
а) Обогащение гибридной плазмиды ДНК (pLO4)
Клетки 25 мл культуры E.coli S17-1 в качестве вспомогательного штамма выращивают при OD546 2,0 и по методу Lederberg и Cohen (J.Bacteriol. 119 (1974), 1072 1074) их делают компетентными.
После промывки этих клеток в 10 мл 0,1 М MgCl2 последние инкубируют в течение 30 мин в 10 мл 0,1 М CaCl2 на льду.
Центрифугируют и снова суспендируют эти клетки в 1 мл 0,1 М CaCl2. По 0,2 мл суспензии клеток смешивают с 0,5 мкг лигированной гибридной плазмидной ДНК для трансформации.
Инкубируют более, чем 30 мин, на льду, в течение 2 мин подвергают кратковременному ("шоковому") нагреву при 42oC.
Затем соответствующие суспензии клеток дополняют до 5 мл предварительно подогретой питательной средой Nutrint Yeast Broth (Oxoid, Wesel, ФРГ), инкубируют в течение 1 ч без встряхивания и следующий час при встряхивании для экспрессии генов при оптимальной температуре роста клеток реципиентов (E.coli S17-1).
Аликвотные части трансформированных культур помещают на соответствующие селективные среды (питательный агар, 100 мкг ампициллина на мл).
б) Трансформация pLO4 в продуцирующий штамм
Из штамма E.coli S17-1 с pLO4 выделяют гибридную плазмиду pLO4 соответственно примеру 1.1 и 1.2.
После этого E.coli K12*, как и в 1.4а, трансформируют с помощью гибридной плазмиды pLO4. Селекцию осуществляют соответственно с помощью селективной среды (питательный агар, 100 мкг ампициллина на мл).
1.5. Трансформация компетентных клеток с помощью гибридной плазмиды pLO5
Соответственно примеру 1.4, гибридную плазмиду pLO5 трансформируют в Pseudomonas putida JD7.
Селекцию осуществляют с помощью селективной среды (питательный агар, 50 мкг канамицина на мл).
Пример 2 8. Соответственно примеру 1.3 готовят гибридную плазмиду pDL3. Соответственно примерам 1.4 и 1.5 гибридными плазмидами pGSH2836, pLO3, pLO4, pLO5 трансформируют штаммы-хозяева E.coli K12*, Pseudomonas aeruginosa PAO25, Pseudomonas pitida JD7 и Pseudomonas putida.
В табл. 2 представлены сведения о полученных продуцирующих штаммах и их способности гидроксилировать метбильные группы.
Пример 9. Конструирование xylB-мутантов.
9.1 Конструирование плазмиды pLO10
Ген xvLMABCN выделяются из плазмиды pGSH2816 (Haramaya et al. J. Becterioi. 171, 1989) с помощью EcoRL и Hpal-рестрикции и затем лигируют в вектор pBR322 (Bolivar et al. Gene 2, 1977, с.95 и последующие).
9.1.1. Расщепление с помощью рестрикционных ферментов и выделение ДНК благодаря гель-электрофорезу на агарозе
Обработанную с помощью Ecorl и HpaI (смотря по обстоятельствам, 5 ед. на мкг ДНК плазмиду pGSH2816 разделяют с помощью препаративного гель-электрофореза на агарозе (0,7% агарозы, в 0,09 М Трис-борате, 2,5 ммоль Na-ЭДТА, pH 8,3) и фрагменты ДНК искомый величиной изолируют (соответственно примеру 1.2).
9.1.2. Лигирование фрагмента ДНК с xylMABCN в pBR322
(Current Protocols in Molecular Biology, John Wlley and Sons, Нью-Йорк, 1988; раздел 3.16 "Subcloning of DNA-frogments").
a) Подготовка вектора ДНК
Перед лигирование ДНК плазмиды pBR322-ДНК (2 мкг) обрабатывают с помощью 10 ед EcoRI и 10 ед Scal в рестрикционном буфере (50 ммоль Трис, 10 ммоль MgCl2, 100 ммоль препаративной агарозы). Посредством гельэлектрофореза выделяют фрагмент размером 3850 пар оснований, как описано в примере 9.1.1.
б) Легирование
Для легирования соответствующие фрагменты ДНУ объединяют (в различных количественных соотношениях при избытке ДНК вставки), смешивают с буфером для лигирования (20 ммоль Трис, 10 DTT, 10 ммоль MgCl2, 0,6 ммоль АТР, pH 7,2) и после добавления 1 ед. Т4-ДНК-лигазы инкубируют в течение ночи при 12
16oC.
Затем легированную смесь используют для трансформации.
в) Трансформация E.coli C600 (соответственно примеру 1.4)
Селекцию осуществляют на питательной среде из агара с тетрациклином (25 мкг/мкл). После рестрикционного контроля больше количества pLO10-ДНК очищают посредством CsCl-градиента.
9.2 Конструирование плазмиды pLO11
9.2.1 Расщепление pLO10-ДНК с помощью рестрикционных фрагментов
5 мкг pLO10-ДНК обрабатывают 22 ед. HindIII в рестрикционном буфере (10 моль Трис, 10 ммоль MgCl2, 50 ммоль NaCl, 1 ммоль DTT, pH 7,5) и подвергают препаративному гель-электрофорезу на агарозе.
Выделяют два фрагмента размерами 3,8 kb и 2,9 kb, как описано в примере 9.1.1, и растворяют в 45 и 30 мкл воды, соответственно. Они содержат вектор pBR322 и область xyl-гена кроме xylB.
9.2.2. Легирование
Оба изолированных в примере 9.2.1 фрагмента используются, как описано в примере 9.1.2. б, для легирования. Для этой цели смешивают 45 мкл фрагмента 3,8 kb, 30 мкл фрагмента 2,8 kb, 10 мкл буфера для лигирования, 10 мкл 10 мМ ATP и 1 мкл T4-ДНК-лигазы и инкубируют в течение ночи при 12 16oC.
Затем ДНК осаждают этанолом и растворяют в 10 мкл воды.
9.2.3 Трансформация E.coli HB101
Полученную согласно примеру 9.2.2 ДНК применяют для трансформации
E.coli HB101 (соответственно примеру 9.2.1в).
Трансформированные клетки подвергают селекции на питательной среде аз агара с тетрациклином (25 мкг/мкл).
9.3. Переведение pLO11 в E.coli HB101, содержащей pRK2013
E.coli HB101, содержащую pRK2013, выбирают в качестве хозяина для pLO11. С помощью закодированных на pRK2013 функций возможна мобилизация ее в другие грамотрицательные бактерии, как, например,
Pseudomonas putida JD7 с помощью pWWO. Изолированную pLO11-ДНК трансформируют, как описано в примере 9.1.2а, в E.coli HB101, содержащую pRK2013. Селекцию осуществляют на питательной среде из агара, содержащей тетрациклин (25 мкг/мкл) и канамицин (25 мкг/мкл).
9.4 Конъюгирование E. coli HB101, содержащий pRK2013 и PLO11 с Pseudomonas putida JD7, содержащей pWWO
Компоненты конъюгирования отделяют от выдержанных в течение ночи культур на центрифуге (2 мл9, промывают многократно в 0,9-ном NaCl (Saline), растворяют в 100 мкл Saline и смешивают в питательной средой с агаром на пластинах. Пластины инкубируют для конъюгирования в течение 6 ч при 30oC. Образовавшиеся клоны бактерий снова суспендируют в 1 мл Saline и наносят в пригодных разбавлениях на питательную агаровую среду с тетрацилином (50 мкг/мкл). Несколько полученных трансконъюгатов с помощью гомологичной рекомбинации pLO11 вводят в TOL-плазмиду.
9.5 Маркерный обмен между pLO11 и PWWO
Для того, чтобы с помощью гомологичной рекомбинации удалить xylB из TOL-плазмиды pWWO в Pseudamonas putida JD7 получают примерно свыше 100 генераций трансконъюгатов E.coli без селекционного давления благодаря присутствию тетрациклина (культивируют). При этом желательно удаление вектора pBR322 и интактного xylB-гена.
Для того, чтобы повысить количество чувствительных к тетрациклину xylB-мутантов, осуществляют селекцию на наличие генов, интегрированных в сектор pBR322.
Клетки помещают в 25 мл комплексной среды Nutrient Yeast Broth (Oxoid, Wesel, BRD) с тетрациклином (50 мкг/мкл) и инкубируют вплоть до OD650 примерно 3,0 при 30oC. Затем добавляют 500 мкг/мл циклосерина C и 100 мкг/мл пиперациллина. После многочасового инкубирования при 30oc наступает почти полный лизис клеток. Клетки, устойчивые к антибиотикам, отделяют на центрифуге, многократно промывают Saline и платтируют (наносят ) в пригодных разбавлениях на питательную агаровую среду. Вплоть до 85% полученных колоний чувствительны к тетрациклину.
9.6. Тест колоний на присутствие xylB-делеции
9.6.1 Обнаружение делении с помощью гибридизации при Саузерн-блотгибридизации
pWWO-ДНК полученных клонов изолируют соответственно методу Kado и Lin (J. Bacteriol. 145, с 1365-1373, (1981)). Для этой цели отделяют на центрифуге 1 мл выдержанной в течение ночи культуры и снова суспендируют в 40 ммоль Трис-ацетатного буфера/, 2 ммоль ЭДТА, pH 7,9. Клетки лизируют путем добавления 200 мкл 3% SDS, pH 12,6, инкубируют в течение 1 ч при 65oC и затем многократно экстрагируют смесью фенола м хлороформом (1:1).
Водный раствор ДНК путем повторной промывки диэтиловым эфиром освобождают от фенола и смешивают с 1/10 объема 3 М ацетата натрия, pH 4,8. После этого ДНК осаждают этанолом и после высушивания растворяют в 100 мкл воды. Примерно 40 мкл этой ДНК-пробы обрабатывают с помощью 100 ед. EcoRl и 5 ед. Hpal в рестрикционном буфере (50 ммоль Трис, 10 ммоль MgCl2, 100 ммоль NaCl, 1 ммоль DTT, pH 7,5) и подвергают гель-электрофорезу на агарозе. Размещенную на нитроцеллюлозных мембранах ДНК гибридизируют с 500 нг маркированного 32P-ATP pLO11 зонда. 1,5 kb xylB-делецию прямо распознают по ауторадиографии.
Пример 10. Получение оксиметилированных гетероциклов
E.coli K12 * выдерживают в течение ночи при 30oC в питательной среде Nutrient Yeast Broth (Oxoid, Wesel, BRD) при добавке указанного в табл. 1 соответствующего антибиотика, согласно примеру 1.4, для стабилизации плазмиды. После этого аликвотную часть переносят в свежую среду и инкубируют следующие 2 ч при 30oC, до индукции ксилолмонооксигеназных генов (табл.1). Индукция экспрессии происходит благодаря добавке 1 ммоль LPTG за счет tac-прототора. Индукционная фаза, смотря по обстоятельствам, составляет 2-4 часа. Суспензию бактерий центрифугируют и осадок клеток после центрифугирования снова суспендируют в свежей среде без добавления антибиотиков, так что устанавливается OD650 10. Эту суспензию затем смешивают с 0,1% (по объему для жидких субстратов, вес/объем для твердых субстратов) окисляемых гетероциклов и инкубируют далее при 30oC. После определенных отрезков времени бактериальную суспензию исследуют на образование продукта.
Пример 11. Соответственно примеру 10 выращивают Pseudomonas putida JD7 с pLO5.
Из-за отсутствия репрессорного гена laclg можно отказаться от индукции с помощью iPTG.
Штамм используют, соответственно примеру 10, для превращения гетероциклов.
Пример 12. Соответственно примеру 10 для превращения используют E.coli K12 * с pGSH2836 (DSM N 6154). Индуктивно осуществляют путем инактивации репрессорного гена c1857, благодаря температурному воздействию в течение 2 ч при 42oC.
Примеры 13 и 14. Соответственно примеру 10, полученные в примерах 2 8 продуцированные штаммы используют для превращения.
Примеры 15 20. Результаты превращения различных гетероциклов с помощью штамма по примеру 12 представлены в табл. 3.
Использование: микробиологическое получение оксиметилированных гетероциклов, которые могут использоваться в составе фармацевтических и агрохимических препаратов. Сущность изобретения: разработка микробиологического способа специфического гидроксилирования метильных групп в ароматических 5- или 6-членных гетероциклах до соответствующих чистых оксиметилированных производных, которые далее не могут катаболизироваться, и получение рекомбинантных плазмидных ДНК, определяющих синтез ксилолмонооксигеназы для гидроксилирования метильных групп указанных гетероциклов, и штаммов бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida, содержащих данные плазмиды. При осуществлении способа используют штаммы бактерий, содержащие рекомбинантные плазмиды pL04 и pL05, в состав которых входит ген ксилолмонооксигеназы TOL-плазмиды Pseudomonas putida, определяющий синтез данного фермента. Указанные штаммы не образуют активной алкогольдегидрогеназы. 5 с. и 3 з. п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
