ТИОМАРИНОЛ C И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1997 года по МПК C07D401/12 C07D495/04 C12P1/06 C12P17/18 C07D495/04 C07D339/02 C07D209/34 

Изобретение относится к некоторым новым производным тиомаринола, предоставляет способ их получения и касается способов и композиций для использования их в качестве антибактериальных агентов.

Тиомаринол описан, например, в Европейской заявке на патент N 512824, которая опубликована до подачи данной заявки, но позже даты ее приоритета. Он может быть представлен следующей формулой:

Его получают ферментацией микроорганизмов вида Alteromonas, в частности Alteromonas rava штамм SANK 73390. Обнаружено два производных тиомаринола, которые проявляют сходный тип антибактериальной активности, что и первоначальный тиомаринол.

Организмы рода Alteromonas могут выть выделены из морской воды и, как было показано, некоторые из них способны производить соединения, которые потенциально пригодны для использования в терапевтических целях. Так, например, соединение, известное под названием бисукаберин было получено из одного вида рода Alteromonas и, как было показано, обладает противоопухолевой активностью (Японская патентная заявка Кокаи N Sho 63-27484).

Что касается структуры тиомаринола, то известно несколько антибиотиков, имеющих сходную структуру, которые можно разбить на четыре группы.

В первую группу входят псевдомоновые кислоты, впервые выделенные из микроорганизмов Pseudomonas spp. Они включают псевдомоновую кислоту A [продуцируемую видом Pseudomonas fluorescens, описанным в J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1, 294 (1997)] псевдомоновую кислоту B [там же, 318 (1977)] псевдомоновую кислоту C [там же, 2827 (1982)] и псевдомоновую кислоту D [там же, 2655 (1983)] Псевдомоновая кислота A выпускается под названием "бактробан" (торговый знак фирмы Beecham) в форме 2%-ной кожной мази для антибактериального использования. Однако все из этих известных из области техники соединений имеют более слабую антибактериальную активность, чем производные тиомаринола по настоящему изобретению.

Вторую группу веществ, имеющих сходство по структуре с соединениями по настоящему изобретению, составляют такие антибиотики, как холомицин (Helv. Chim, Acta, vol. 42, 563 (1959)] пирротин [J. Am. Shem. Soc. vol. 77, 2861 (1955)] тиолутин [Angew. Chem, Bd. 66, 745 (1954)] лауреотрицин [J. Am. Chem. Soc. vol. 74, 6304 (1952)] и другие. Эти антибиотики обычно продуцируются актиномицитами и отличаются тем, что имеют в своем составе серусодержащий хромофор. Ксенорхабдины I-V являются веществами, родственными холомицину, и были также выделены из бактерий (описанных в WO /01775).

Были проведены многочисленные исследования производных этих двух групп соединений, однако у нас нет каких-либо сведений о соединениях, имеющих молекулярную структуру, сходную со структурой тиомаринолов, или обладающих аналогичными свойствами.

Третья группа соединений описана в таких публикациях, как патентные заявки Японии Кокаи NN 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 и 54-125672. Ее составляют производные псевдомоновой кислоты, в которых концевая карбоксильная группа заменена амидной группой. Эти соединения не проявляют сравнимую антибактериальную активность и не обладают широким спектром антибактериальной активности. Фактически эти соединения имеют тенденцию обладать меньшей антибактериальной активностью, чем исходная псевдомоновая кислота.

Четвертая группа включает соединение, сходное с тиомаринолом в том, что оно является физиологическим продуктом жизнедеятельности морских бактерий [Рефераты статей 200 Ежегодной конференции Американского химического общества (26-31 августа 1990), часть 2, N 139] Однако гетероциклической группой, присоединенной к концевой карбоксильной группе этого соединения, является 2-оксо-3-пиперидильная группа. Как недавно было показано, она обладает антимикробной активностью [Experimentia, Vol 48, pp. 1165-169, 1992]
Однако считается, что наиболее близким известным соединением является псевдомоновая кислота A, а все тиомаринолы, т.е. сам тиомаринол, тиомаринол B и тиомаринол C, обладают значительно более сильной антибактериальной активностью, чем псевдомоновая кислота A.

Целью настоящего изобретения является предоставление некоторых новых производных тиомаринола.

Следующей и более специфической целью настоящего изобретения является предоставление соединений, которые обладают превосходной антибактериальной и антимикоплазменной активностью.

Другие цели и преимущества станут понятны при рассмотрении описания изобретения.

В общем смысле настоящее изобретение предоставляет два новых производных тиомаринола, одно из которых является S,S-диоксо производным и далее обозначается как "тиомаринол B", и является объектом рассмотрения в заявке N 93053043/13, из которой выделена данная, а второе является дезоксипроизводным и далее обозначается как "тиомаринол C".

Более конкретно настоящее изобретение предоставляет соединение тиомаринол C, который может быть представлен следующей формулой:

Изобретение предоставляет также способ получения тиомаринола C, который предусматривает культивирование продуцирующих тиомаринол микроорганизмов вида Alteromonas и выделение тиомаринола C из культуры.

Из представленной выше формулы видно, что тиомаринол C содержит ряд асимметрических атомов углерода и несколько кратных связей. В частности, возможна изомеризация в α,b-ненасыщенном карбонильном фрагменте тиомаринола. Таким образом, тиомаринол может образовывать различные стерео- и геометрические изомеры. Хотя все они представлены здесь одной молекулярной формулой, настоящее изобретение включает в себя как индивидуальные, выделенные изомеры, так и их смеси, включая рацематы. При получении смеси изомеров индивидуальные изомеры могут быть получены обычными методами расщепления.

Однако поскольку тиомаринолы, как правило, получают ферментацией или химическими манипуляциями с продуктами ферментации, они имеют тенденцию приобретать стандартную оптическую конфигурацию. Поэтому, хотя предоставляются и другие конфигурации, предпочтительной является природная конфигурация.

Тиомаринол C может быть охарактеризован следующими физико-химическими свойствами:
1. Характер и внешний вид: порошок желтого цвета.

2. Молекулярная формула C₃₀H₄₄N₂O₈S₂.

3. Молекулярная масса: 624 (по данным FAB масс-спектрометрии).

4. Элементный анализ:
Вычислено для C₃₀H₄₄N₂O₈S₂ + H₂O, C 56,05, H 7,21, N 4,36, S 9,97.

Найдено, C 56,48, H 7,23, N 4,30, S 9,11.

5. ИК спектр: n_max см^-1.

ИК спектр, снятый для образца в виде таблетки с бромистым калием: 3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384, 1287, 1225, 1151, 1104, 1052, 974, 820, 712.

6. УФ спектр: λ_max, нм (ε).

УФ спектр, измеренный в метаноле или смеси метанол + соляная кислота: 388 (9600), 300 (2700), 215 (17000).

УФ спектр, измеренный в смеси метанол + едкий натр: 386 (8600), 205 (49000).

7. Удельное вращение плоскости поляризации:
[α]25D

8. Жидкостная хроматография высокого разрешения:
Разделительная колонка: Senshu-Pak ODS H-2151 (диаметр колонки 6 мм, длина 150 мм, Senshu Scientific Co. Ltd.).

Растворитель: 40 об. водный ацетонитрил.

Скорость потока элюента: 1,5 мл/мин.

Время удерживания: 11,3 мин.

9. ¹H-ЯМР спектр: ( δ м.д.).

ЯМР спектр (360 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта: 0,91 (3H, дублет, J 6,9 Гц), 0,95 (3H, дублет, J 6,3 Гц), 1,26 (2H), 1,29 (2H), 1,30 (2H), 1,51 (2H, мультиплет), 1,56 (2H, мультиплет), 1,63 (1H, мультиплет), 2,06 (2H), 2,08 (1H), 2,11 (3H, синглет), 2,15 (1H), 2,34 (2H, триплет, J 7,3 Гц), 2,56 (1H, широкий дублет, J 14,2 Гц), 3,18 (1H, широкий мультиплет), 3,35 (1H), 3,49 (1H), 3,58 (1H), 3,62 (1H), 3,67 (1H), 4,01 (2H, триплет, J 6,6 Гц), 4,32 (1H, дублет, J 4,3 Гц), 4,55 (1H, широкий мультиплет), 4,64 (1H, широкий синглет), 5,33 (1H, мультиплет), 5,37 (1H, мультиплет), 5,68 (1H, синглет), 7,05 (1H, синглет), 9,81 (1H, синглет), 10,70 (1H, синглет).

10. ¹³C-ЯМР спектроскопия: ( d м.д.).

ЯМР спектр (90 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта: 15,7 (квартет), 18,6 (квартет), 20,0 (квартет), 24,9 (триплет), 25,2 (триплет), 28,1 (триплет), 28,3 (триплет), 28,4 (триплет), 32,1 (триплет), 34,6 (триплет), 42,0 (дублет), 42,5 (триплет), 43,1 (дублет), 63,0 (триплет), 64,0 (триплет), 68,1 (дублет), 69,2 (дублет), 69,3 (дублет), 74,4 (дублет), 110,4 (дублет), 115,3 (синглет), 116,5 (дублет), 127,6 (дублет), 133,6 (синглет), 133,9 (синглет), 134,2 (дублет), 157,9 (синглет), 165,7 (синглет), 167,9 (синглет), 171,8 (синглет).

11. Растворимость. Растворим в спиртах, таких как метанол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, хлороформе, этилацетате, ацетоне и диетиловом эфире. Нерастворим в гексане и воде.

12. Тонкослойная хроматография.

Величина R_f 0,66.

Адсорбент: силикагель (фирма Merck Co. Inc. Art. 5719).

Элюент: хлористый метилен:метанол 85:15 по объему.

Тиомаринол C можно получить путем культивирования продуцирующих тиомаринол организмов вида Alteromonas и выделения целевого тиомаринола из культуральной среды. Разновидности тиомаринола C с требуемой антибактериальной активностью могут быть получены аналогично из других штаммов или видов Alteromonas, которые продуцируют целевое соединение, или же их можно получить, модифицируя подходящим образом соединение, выделенное в процессе указанной выше ферментации, или же их можно получить прямым химическим синтезом.

В частности, нам представляется более предпочтительным использовать в качестве микроорганизма вид Alteromonas rava и особенно недавно выделенный штамм Alteromonas rava, которому мы дали обозначение SANK 73390. Штамм SANK 73390 является морским организмом, который выделен из морской воды, собранной у побережья Коина, Минамата, префектура Сизуока, Япония, и указанный штамм депонирован в Депозитарном институте, Исследовательском институте ферментации, Агентство промышленной науки и технологии, Министерства международной торговли и промышленности, Япония, 30 апреля 1991 г. депозитарный номер FERM BP-3381, в соответствии с Будапештским соглашением.

Таксономические характеристики Alteromonas rava штамм SANK 73390 представлены ниже.

1. Морфологические характеристики.

Alteromonas rava штамм SANK 73390 культивировался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Последовательные микроскопические наблюдения показали, что клетки имеют палочкообразную форму с диаметром 0,8 1,0 мкм и длиной 2,0 3,6 мкм. Этот штамм является грамотрицательным и перемещается с помощью бактериальных жгутиков.

2. Рост на морском агаре.

SANK 73390 культивировался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Полученные колонии имеют бледный серо-зеленый цвет, непрозрачны, плоские, сплошные и имеют кольцевую форму.

Водорастворимый пигмент не образуется.

3. Физиологические свойства.

(1) Требования к морской воде: SANK 73390 требует для своего роста морскую воду.

(2) Окислительно-ферментативный тест (метод Хью-Лейфсона [J. Bact. vol. 66, 2426, 1953] в среде, приготовленной из искусственной морской воды, не оказывает воздействия на углевод.

(3) Оксидаза: +
(4) Каталаза: +
(5) Потребность в кислороде: аэробный.

(6) Восстановление нитратов: -
(7) Гидролиз крахмала: +
(8) Разложение агара: -
(9) Разжижение желатина: +
(10) Продуцирование дифосфопиридиновой нуклеотидазы (ДНазы): +
(11) Продуцирование липазы: +
(12) Температура для роста: плохой рост при 4^oC, хороший рост в интервале 17 26^oC, отсутствие роста при 35^oC.

(13) Требования к факторам роста: на основной питательной среде, описанной в J. Bact. vol. 107, 268 (1971), SANK 73390, требует добавления свободной от витаминов казамино-кислоты.

(14) Ассимиляция источников углерода: на основной питательной среде, описанной в J. Bact. vol. 107, 268 (1971), дополнительно содержащей 0,1% вес. /об. свободную от витаминов казамино-кислоту, при встряхивании культуры (см. табл. 1).

4. Хемотаксономические характеристики.

(1) Мол. гуанина и цитозина (содержание Г+Ц) в ДНК: 43,4% ( по данным жидкостной хроматографии высокого разрешения).

(2) Хиноновая система: убихинон Q-8.

Принимая во внимание приведенные выше таксономические характеристики, Alteromonas rava штамм SANK 73390 сравнивали со штаммами, описанными в Bergey's Manual of Systematik Bacteriology, Vol. 1 (1984), а также со штаммами, описанными в последних выпусках International Journal of Bacteriology. Обнаружено, что Alteromonas rava штамм SANK 73390 в некоторой степени обнаруживается сходство с Alteromonas citrea, который также является морским организмом. Проведено выращивание и сравнение свойств SANK 73390 и Alteromonas citrea, АТСС 29719 (стандартный штамм).

В сравнении с бледно-серовато-желтого цвета SANK 73390, колонии АТСС 29719 имели зеленовато-желтый цвет. SANK 73390 отличается от Alteromonas citrea скоростью роста при 4^oC и способностью усваивать трегалозу и пропионат натрия в качестве источников углерода. Следовательно, штамм Alteromonas rava SANK 73390 является новым штаммом нового вида Alteromonas rava и отличается по своим важнейшим характеристикам от ближайшего аналога, депонированного под номером АТСС 29719.

Приведенные выше характеристики являются типичными для SANK 73390. Однако, как известно, характеристики образцов Alteromonas spp. могут меняться как естественным, так и искусственным путем. Приведенные выше характеристики определяют штамм Alteromonas rava в том виде, в котором он был депонирован, но необязательно типичным для других видов рода Alteromonas или штаммов Alteromonas rava, которые обладают способностью продуцировать тиомаринол или его встречающиеся в природе варианты. Все такие штаммы включены в объем притязаний по настоящему изобретению.

Понятно, что SANK 73390 или любой другой штамм, способный продуцировать тиомаринол или одну из его разновидностей, может быть подвергнут субкультивированию, изменен биотехнологическим путем или модифицирован с целью продуцирования организма с различными характеристиками. Единственным требованием к получаемому организму является способность продуцировать требуемое соединение.

Такие изменения или модификации могут принимать любую желаемую форму или же могут, например, зависеть от условий выращивания культуры. Штаммы можно так изменить при выращивании и выбрать таким образом, чтобы получить образцы, обладающие такими свойствами, как увеличенная скорость роста, рост при более высоких или более низких температурах.

Биотехнологические модификации, как правило, осуществляют намеренно, и могут вводить селективные характеристики, такие как, например, устойчивость или восприимчивость к бактериостату или их комбинацию, чтобы поддержать чистоту, или обеспечивать возможность очистки культуры, особенно элитных культур.

Другими характеристиками, которые могут быть введены при генетических манипуляциях, являются любые из тех, что допустимы в случае Alteromonas spp. Например, можно ввести плазмиды, кодирующие сопротивляемость, или удалить любые природные плазмиды. Наибольшие преимущества предоставляют те плазмиды, которые обладают способностью образовывать штаммы мутанта растущего организма. Плазмиды можно получить из любого удобного источника или сформировать методами генной инженерии, выделив природную плазмиду Alteromonas и вводя в нее нужный ген или гены из другого источника. Природные плазмиды можно также модифицировать любым другим желаемым образом.

Для того чтобы получить тиомаринол C из культуры подходящего микроорганизма, микроорганизмы необходимо подвергнуть ферментации в подходящей среде. Такие среды, как правило, хорошо известны из области техники и часто используются при производстве других ферментативных продуктов.

Обычно такая среда должна содержать любую комбинацию источника углерода, источника азота и одной или более неорганических солей, которые усваиваются соответствующим микроорганизмом. Минимальным требованием к среде является то, что она должна содержать такие ингредиенты, которые необходимы для роста микроорганизма.

Подходящими источниками углерода являются глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, маннит, глицерин, декстрин, овсяная мука, рожь, кукурузный крахмал, картофель, кукурузная мука, соевая мука, хлопковое масло, патока, лимонная кислота и винная кислота, каждый из которых может применяться самостоятельно или же в сочетании с одним или более других источников углерода. Типичные количества составляют 1 10% вес./об. от количества среды, хотя эта величина может изменяться в зависимости от потребности и в соответствии с желаемым результатом.

Подходящими источниками азота могут быть любые вещества, которые содержат, например, белок. Типичными примерами источников азота являются органические источники азота, получаемые от животных и растений, это могут быть экстракты, выделенные из таких природных источников, как соевая мука, отруби, арахисовая мука, мука из семян хлопчатника, гидролизат казеина, фермамин, рыбная мука, кукурузный экстракт, пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, и неорганические источники азота, такие как нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония. Так же как и в случае источников углерода, их можно использовать отдельно или же в сочетании друг с другом. Типичные количества составляют 0,1 6% вес./об. от количества среды.

Подходящими питательными неорганическими солями являются те, которые обеспечивают микроэлементы, а также основные солевые составляющие. Соли должны преимущественно содержать такие ионы, как ионы натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, фосфат-, сульфат-, хлорид- и карбонат-ионы. Могут также присутствовать следы таких металлов (или микроэлементов) как кобальт, марганец или стронций, или соли, способные давать такие ионы, как бромид-, фторид-, борат- и силикат-ионы.

Alteromonas rava встречается в природе в морской воде, поэтому, если специально не оговорено, условия для выращивания этих организмов должны идеально соответствовать условиям морской среды обитания. Так, ионы, которые в виде следов содержатся в морской воде, преимущественно включаются в любую среду, используемую для выращивания Alteromonas. В частности, микроорганизмы должны предпочтительно выращиваться в присутствии морской воды, искусственной морской воды или компонентов, соответствующих составу морской воды.

Если микроорганизм ферментатируют в виде жидкой культуры, то желательно использовать пеногасители, такие как силиконовое масло или растительное масло или другие подходящие поверхностно-активные вещества.

При использовании штамма Alteromonas rava SANK 73390 для получения тиомаринола кислотность среды для выращивания должна преимущественно поддерживаться 5,0 8,0 pH, хотя единственным требованием является то, чтобы кислотность среды не препятствовала росту микроорганизма или вредно и необратимо не влияла на выход целевого продукта. Для прекращения ферментации можно добавлять избыток кислоты или щелочи. Alteromonas rava SANK 73390, как правило, растет при температуре 4 32^oC, хорошо растет при температуре 17 26^oC. Можно работать и при других температурах, которые не попадают в указанный интервал, в том случае, если выделен штамм, способный расти при более низких или высоких температурах. Для получения тиомаринола C интервал температуры должен преимущественно составлять 20 26^oC.

Тиомаринол C идеально получается при аэробном культивировании, и можно применять любую методику аэробного выращивания, например, твердую культуру, встряхиваемую культуру или перемешиваемую воздухом культуру.

Если культивирование проводят в небольшом масштабе, то обычно более предпочтительна встряхиваемая культура, которую ферментатируют в течение нескольких дней при температуре 20 26^oC.

Для начала ферментативного выращивания предпочтительно использовать методику с использованием исходного инокулюма, приготовленного в одну или две стадии, например, в колбе Эрленмейера. Для культуральной среды можно использовать комбинацию источника углерода и источника азота. Колбу с посевным материалом встряхивают в термостатируемом инкубаторе при 23^oC в течение 1 3 дней или же до тех пор, пока не начнется ощутимый рост. Полученную посевную культуру можно далее использовать для высева второй посевной культуры или продуцирующей культуры. Если проводят повторный высев, его можно осуществлять обычным способом, а часть использовать для инокуляции продуцентной среды. Среду, в которую помещается посевной материал, встряхивают при соответствующей температуре в течение необходимого количества времени, например от 1 до 3 дней, или же до тех пор, пока не начнется заметное образование продукта, как это описано выше. После окончания инкубационного периода содержимое колбы разделяют центрифугированием или фильтрованием.

Если выращивание проводят в больших масштабах, то предпочтительно использовать культуру, перемешиваемую воздухом в ферментере. В этом случае питательную среду можно приготовить прямо в ферментере. После стерилизации при 125^oC полученную среду охлаждают и засевают инокулюмом, предварительно приготовленным в стерильной среде. Выращивание проводят при перемешивании и аэрации при температуре 20 26^oC. Эта методика пригодна для получения соединения в больших количествах.

Количество тиомаринола, вырабатываемого культурой, можно время от времени контролировать с помощью, например, жидкостной хроматографии высокого разрешения. Как правило, количество продуцированного тиомаринола C достигает максимума в интервале времени 19 200 ч, а количество продуцированного тиомаринола достигает максимума в интервале времени 19 96 ч.

По истечении подходящего времени выращивания тиомаринол C можно выделить и очистить любыми известными способами. Например, либо количество C, оставшееся в бульоне с культурой, можно получить отфильтровыванием твердых веществ, например используя в качестве материала для фильтрования диатомную землю, или центрифугированием с последующей экстракцией жидкости над осадком и очисткой в соответствии с физико-химическими свойствами тиомаринола C. Например, тиомаринол C, находящийся в фильтрате или в остатке после центрифугирования, можно экстрагировать несмешиваемыми с водой органическими растворителями, такими как этилацетат, хлороформ, хлористый этилен, хлористый метилен или смесь указанных растворителей в нейтральных или кислых условиях, а затем очистить.

Альтернативно в качестве адсорбента можно использовать активированный уголь или адсорбирующие смолы, такие как Amberlit (торговый знак) XAD -2, XAD -4 (фирма Rohm Haas) или Diaion (торговый знак) HP-10, Hp-20, CHP-20, HP-50 (фирма Mitsubishi Kasei Corporation). Примеси можно удалить после адсорбции, пропуская жидкость, содержащую тиомаринол C, через тонкий слой адсорбента, тиомаринол C можно также очистить после адсорбции элюированием подходящим растворителем, например, водным метанолом, водным ацетоном или смесью бутанол/вода.

Внутриклеточный тиомаринол C можно очистить экстракцией подходящим растворителем, например, водным ацетоном или водным метанолом, который предпочтительно имеет концентрацию 50 90 об. и удалением органического растворителя с последующей экстракцией, как это описано ранее для фильтрата или жидкости над осадком.

Дальнейшую очистку тиомаринола C можно осуществить с помощью хорошо известных методов, а именно:
адсорбционной колоночной хроматографией, используя такие носители, как силикагель или магний-силикагель, например, поставляемый в продажу под торговым названием "флорисил";
распределительной колоночной хроматографией, используя такие адсорбенты, как Sephadex LH-20 (торговое название продукта фирмы Pharmacia);
жидкостной хроматографией высокого разрешения с использованием колонок с нормальными или обращенными фазами.

Как хорошо известно из области техники, эти способы выделения и очистки можно осуществлять отдельно или в любом удобном сочетании, а если необходимо, и многократно с целью выделения и очистки целевого продукта.

Поскольку тиомаринол C обладает антибактериальным воздействием на грампозитивные и грамнегативные бактерии и микоплазмы в животных организмах (в частности человека, собаки, кошки и кролика), его можно самыми разнообразными способами в зависимости от природы инфекции использовать для лечения или профилактики бактериальных или микоплазменных инфекций.

В том случае, если соединение по настоящему изобретению предполагается использовать в терапевтических целях, его можно назначать самостоятельно или в виде фармацевтической композиции, содержащей, помимо активного соединения, один или два стандартных разбавителя, носителя, инертных наполнителя или вспомогательных соединений. Форма композиции, естественно, будет зависеть от способа приема лекарства. Для орального назначения соединение преимущественно преобразуется в форму препарата в виде порошков, гранул, таблеток, капсул или сиропов. Для парентерального назначения оно преимущественно приготавливается в виде инъекционных препаратов (которые могут быть внутривенными, внутримышечными или подкожными), капель, свечей, мазей или линиментов.

Эти формы препаратов могут быть приготовлены известными способами добавлением к активному соединению таких добавок, как носители, связующие, разрыхлители, смазки, стабилизаторы, модификаторы, смачиватели, ароматизирующие вещества, отдушки, диспергаторы или материалы для покрытия оболочкой. Хотя доза может зависеть от симптомов заболевания и возраста пациента, природы и степени тяжести инфекции, а также от способа назначения лекарств, в случае орального назначения взрослому больному соединение по настоящему изобретению может обычно применяться в виде дневной дозы 20 2000 мг. Соединение можно принимать в виде разовой дозы или порциями, например два или три раза в день.

Получение соединения по настоящему изобретению далее поясняется следующим примером, который не ограничивает настоящее изобретение, а биологическая активность соединения иллюстрируется далее в примерах испытаний.

Пример. Получение тиомаринола C выращиванием в тенке.

А) Культура.

Один скос морского агара (Difco), на котором высажен и выращен штамм Alteromonas rava SANK 73390, помещают в 10 мл стерилизованного морского бульона (Difco) для получения суспензии бактерий.

30-литровый ферментер кувшинного типа, содержащий 15 л того же морского бульона, стерилизуют при нагревании, а затем в него высевают все количество бактериальной суспензии и выращивают в течение 24 ч при температуре 23^oC и скорости подачи воздуха 7,5 л/мин. Первоначальная скорость перемешивания составляет 100 об/мин, а затем ее подбирают таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода составляла 5 промилей.

В каждый из 600-литровых тенков помещают по 300 л питательной среды, имеющей следующий состав,
Глюкоза 1,5
Бактопептон (Difco) 1,5
Бактодрожжевой экстракт (Difco) 0,2
NaCl 3,89
MgCl₂•6H₂O 2,52
Na₂SO₄ 0,648
CACl₂•2H₂O 0,4767
KCl 0,11
Na₂CO₃ 0,038
Цитрат железа 0,02
pH 7,6 до стерилизации.

Тенки стерилизуют нагреванием, и затем в каждый из них высевают по 3 л культуры и выращивают в течение 29 ч при 23^oC и скорости подачи воздуха 150 л/мин. Первоначальная скорость перемешивания составляет 82 об/мин, а затем ее подбирают таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода составляла 5 промилей.

Б) Выделение.

К 700 л полученного раствора с культурой добавляют достаточное количество водного раствора соляной кислоты с тем, чтобы довести pH дo 3. Затем к полученной смеси добавляют 700 л ацетона и экстрагируют смесь при перемешивании в течение 1 ч. Полученный экстракт, в свою очередь, экстрагируют один раз 700 л этилацетата, а затем дважды по 300 л этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты промывают сначала 300 л 5%-ного водного раствора бикарбоната натрия, а затем 300 л насыщенного водного раствора хлористого натрия, после чего их сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме. В процессе упаривания добавляют 540 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха.

Полученный таким образом остаток суспендируют в хлористом метилене, и полученную суспензию помещают в колонну с 4 кг силикагеля, насыщенного хлористым метиленом. Элюируют сначала смесью хлористого метилена и этилацетата (1: 1 по объему), затем одним этилацетатом и, наконец, смесью этилацетата и метанола (9:1), при этом полярность элюентов возрастает в указанном порядке. После того как элюат разделяют на порции по 2 л каждая, собирают фракцию, содержащую тиомаринол C, который элюируется смесью этилацетата и метанола, и упаривают ее досуха при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 50 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха.

Остаток суспендируют в смеси гексана и ацетона, полученную суспензию помещают в колонку с 200 г силикагеля, насыщенного гексаном, и элюируют смесью гексана и ацетона (1:1). Элюат разделяют на порции по 500 мл каждая, получая фракции 1 и 2, содержащие тиомаринол C. Фракцию 1 упаривают при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 25 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха.

Полученный остаток суспендируют в смеси гексана, ацетона и этилацетата (1: 1: 2 по объему), полученную суспензию помещают в колонку с 200 г силикагеля, насыщенного гексаном, и элюируют смесью гексана, ацетона и этилацетата (1: 1:2). Элюат разделяют на порции по 500 мл каждая и выделяют фракции, содержащие тиомаринол C. Эту фракцию объединяют с фракцией 2, полученной выше, и упаривают при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 20 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха.

Полученный остаток суспендируют в смеси гексана, ацетона и этилацетата (1: 1: 1 по объему), полученную суспензию помещают в колонку с 200 г силикагеля, насыщенного гексаном, и элюируют смесью гексана, ацетона и этилацетата (1:1:1). Элюат разделяют на порции по 500 мл каждая, и выделяют фракции, содержащие тиомаринол C, и упаривают при пониженном давлении, получая маслянистое вещество.

Все полученное маслянистое вещество подвергают дальнейшей хроматографической очистке, используя колонку с Sephadex LH-20 емкостью 200 мл, насыщенную смесью хлористого метилена, этилацетата и метанола (19:19:2 по объему), элюируя той же смесью растворителей. Собирают фракцию, содержащую тиомаринол C, которую упаривают при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 25 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха.

Полученный таким образом остаток суспендируют в хлористом метилене, и полученную суспензию помещают в колонку с 250 г силикагеля, насыщенного хлористым метиленом. Элюируют смесью хлористого метилена и ацетона в соотношении, изменяющемся от 9:1 к 1:9 таким образом, чтобы полярность элюента постепенно возрастала. Элюат разделяют на порции по 1 л каждая, фракции, содержащие тиомаринол C, собирают и упаривают досуха при пониженном давлении, получая 150 мг тиомаринола C, который имеет физико-химические параметры, приведенные выше.

Биологическая активность тиомаринола C подтверждается следующими примерами испытаний, в которых они сравниваются с псевдомоновой кислотой A и тиомаринолом.

Пример испытаний 1. Антибактериальная активность тиомаринола C.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) тиомаринола, тиомаринола C и псевдомоновой кислоты A (обозначены, соответственно, через A, C и P), выраженную в мкг/мл, по отношению к грампозитивным и грамнегативным бактериям определяют методом разбавления агара, используя питательную агаровую среду (продукт компании Eiken Chemical Co. Ltd.).

Полученные результаты представлены в табл. 2.

Пример испытаний 2. Антимикоплазменная активность тиомаринола C.

По аналогичной методике, приведенной в примере испытаний 1, проводят количественное определение активности тиомаринола, тиомаринола C и псевдомоновой кислоты А (обозначены, соответственно, как A, C и P) по отношению к различным образцам микоплазмы. Результаты представлены в табл. 3.

Инокулюм: 0,005 мл 10 CFU/мл.

Среда для анализа: для всех типов микроорганизмов испытания тиомаринола C и псевдомоновой кислоты A проводят в среде Ченока (получают по методике, приведенной в P. N. A. S. v. 48, 41 49 (1962)) с добавлением 20% лошадиной сыворотки.

Тиомаринол подвергают анализу в следующих средах:
M. Bovis и M. gallisepticum: среда Ченока (получают, как указано выше).

M. hoysynoviae: агаровая среда с муцином PPLO (плевро-пневмониальноподобный организм) с добавлением 15% сыворотки лошади.

PPLO бульон без CV (Difco) 21 г
Муцин бактериальный (Difco) 5 г
Вода дистиллированная 800 мл
Агар благородный (Difco) 12 г
Конская сыворотка 150 мл
25%-ный свежий дрожжевой экстракт 50 мл
Условия выращивания культуры: 37^oC, 5 дней, слегка аэробная среда (метод газового укутывания, выращивание в генераторе CO₂ одноразового использования фирмы Becton Dickinson Microbiology Systems, Коккисвиль, Мэриленд, США).

Из представленных результатов ясно, что тиомаринол C проявляет превосходную антибактериальную и антимикоплазменную активность, которая по крайней мере не хуже, чем у тиомаринола, и в общем случае значительно выше, чем активность псевдомоновой кислоты А.

Производное тиомаринола, которое проявляет антибактериальные и антимикоплазменные свойства, полученное из микроорганизмов рода Alteromonas и называется "тиомаринол C". 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Тиомаринол С формулы

2. Способ получения тиомаринола С, отличающийся тем, что штамм микроорганизма Alteromonas rava FERM ВР-3381 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта.