СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/60 

Изобретение относится к области медицины и медицинской промышленности, в частности к способам получения иммуностимуляторов из молок отходов переработки лососевых рыб.

Препарат, получаемый по предлагаемому способу, может быть использован для стимулирования иммунного ответа, например, у животных продуцентов, сельскохозяйственных животных и человека, а также при производстве иммунных сывороток.

Уровень техники заключается в следующем. Известен способ получения ДНК из молок осетровых рыб, заключающийся в том, что гомогенизацию и экстрагирование молок проводят в солевом растворе, содержащем цитрат и хлорид натрия (авт. св. СССР N 1410494, кл. C07М21/04, 1986).

Способы получения иммуностимуляторов из молок рыб неизвестны.

Наиболее близким аналогом является способ получения иммуностимулятора, включающий замораживание обработанных ацетоном лимфFтических узлов животных, измельчение их, экстрагирование 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, обработку нFдостаточной жидкости ацетоном, отделение осадка и выделение целевого продукта (авт. св. СССР N 1187824, кл. А61К35/30, 1985).

Недостатком данного способа является трудоемкая технология с использованием ацетона, являющегося экологически вредным веществом.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Изобретение направлено на исключение из технологии этапа осаждения целевого продукта ацетоном за счет получения иммуностимулятора методом ультрафильтрации через пористый материал с пределом разделения 5000 Д и использования в качестве сырья молок лососевых рыб, являющихся отходами переработки продуктов моря.

Технический результат заключается в упрощении процесса получения иммуностимулятора по экологически чистой технологии с более высокой активностью.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, заключаются в следующем.

Ограничительные признаки: замораживание сырья, измельчение, экстрагирование 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, фильтрование, отделение недостаточной жидкости и выделение целевого продукта.

Отличительные признаки: в качестве сырья используют молоки лососевых рыб, экстрагирование проводят в течение 24-48 ч с последующими ультра- и диафильтрацией экстракта в растворе 0,9% хлорида натрия с pH 6,0-6,5 через пористый материал с пределом разделения 5000 Д.

Использование в качестве сырья молок лососевых рыб позволяет утилизировать биологически ценное сырье из отходов рыбопереработки.

Экстрагирование в течение 24-48 ч позволяет увеличить выход биологически активной фракции препарата. Ультрафильтрация заменяет процесс осаждения целевого продукта ацетоном. Диафильтрация экстракта в растворе 0,9% хлорида натрия с рН 6,0-6,5 через пористый материал с пределом разделения 5000 Д способствует более полному удалению низкомолекулярных примесей из центрифугата, а также выделению биологически активной фракции.

Пример. 5 кг замороженных молок лососевых рыб измельчают на мясорубке и заливают 30 л апирогенной дистиллированной воды, содержащей 90 г хлорида цинка и перемешивают. Экстрагирование проводят, добавив 900 мл уксусной кислоты, в течение 24-48 ч при периодическом перемешивании в условиях комнатной температуры. Затем проводят очистку экстракта. Экстракт центрифугируют при 3000 об/мин в течение 40 мин. Осадок выбрасывают. Центрифугат подвергают фильтрации через мембранные фильтры с размерами пор 0,8; 0,45; 0,22 мкм последовательно.

Получают 32 л очищенного стерильного фильтра, к которому доливают 130 л 0,9% раствора хлорида натрия рН 6,0-6,5 и проводят диа- и ультрафильтрацию разведенного экстракта на полых волокнах с пределом разделения 5000 Д. Очищенный экстракт концентрируют до содержания 0,5 мг белка в 1 мл. Полученные 1,5 л полуфабриката подвергают стерилизующей фильтрации на мембранных фильтрах. Стерильный препарат разливают во флаконы или ампулы и подвергают лиофильному высушиванию. В результате получают препарат нетоксичный, стерильный, апирогенный для инъекций. Выход целевого продукта 6 г (0,12%) от исходного сырья.

Препарат, полученный из молок лососевых рыб, порошок белого цвета, содержит комплекс полипептидов и белков, с молекулярной массой 5000 20000 Д. Спектр поглощения 280 ± 2 нм. Обладает иммуномодулирующей активностью в дозах 0,01-0,1 мг на 1 кг массы. Специфическую активность иммуностимулятора, полученного из молок лососевых рыб, оценивали в сравнении с иммуностимулятором из лимфатических узлов животных (прототип) по влиянию на иммунодефицит и Т-лимфоциты.

Модель иммунодефицита создавали переносом мышам тимоцитов (6 • 10⁶) адъювант-артритных крыс. О степени угнетения иммунной системы судили по выраженности иммунного ответа на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации этих же мышей эритроцитами барана, определяя уровень АОК, розеткообразующих лимфоцитов крови (РОК), титр гемагглютининов (табл. 1).

Предлагаемый иммуностимулятор из молок лососевых рыб и иммуностимулятор (прототип) вводили подкожно ежедневно, начиная сразу же после инъекции эритроцитов барана. Контрольным мышам вводили изотонический раствор хлорида натрия.

Оценка влияния предлагаемого препарата из молок лососевых рыб и препарата из лимфоузлов животных (прототипа) на Т-лимфоциты проведена в реакции "активного" розеткообразования (Еа РОК), обработанных трипсином тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика (табл. 2).

Как видно из данных табл. 1 и 2, препарат, полученный из молок лососевых рыб, по ряду показателей (АОК, поздние РОК, Еа РОК) превосходит иммуностимулятор, полученный из лимфатических узлов животных (прототип) и может быть использован в качестве иммуностимулятора.

Использование: область медицины и медицинской промышленности, в частности способ получения иммуностимулятора из отходов переработки лососевых рыб. Технический результат: упрощение процесса получения иммуностимулятора по экологически чистой технологии с более высокой активностью, а также утилизация биологически ценного сырья - молок лососевых рыб, являющихся отходами рыбопереработки. Сущность изобретения: в качестве источника сырья используют молоки лососевых рыб, которые предварительно замораживают, измельчают, подвергают экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка в течение 24-48 ч. Экстракт очищают центрифугированием и фильтрацией. Ультра- и диафильтрацию экстракта проводят в растворе 0,9% хлорида натрия pH 6,0-6,5 через пористый материал с пределом разделения 5000 Д. Препарат стерилизуют, разливают во флаконы и лиофильно высушивают. Выход препарата 0,12% от исходных свежемороженных молок. Полученный препарат обладает иммуномодулирующей активностью в дозе 0,01-0,1 мг на 1 кг массы и может быть использован как иммуностимулятор. 2 табл.

Способ получения иммуностимулятора, включающий замораживание сырья, измельчение, экстрагирование 3% -ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, фильтрование, отделение надосадочной жидкости и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют молоки лососевых рыб, экстрагирование проводят в течение 24 48 ч с последующими ультра- и диафильтрацией экстракта в растворе 0,9% хлорида натрия с рН 6,0 - 6,5 через пористый материал с пределом разделения 5000 D.