ИМУННО-КОНДУКТОМЕТРИЧЕСКАЯ СИСТЕМА И СЕНСОРНЫЙ КОМПЛЕКС Российский патент 1997 года по МПК G01N33/487 G01N33/53 G01N33/537 G01N27/02 G01N27/28 

Изобретение относится к средствам определения состояния и классификации биологического материала.

Известны системы, содержащие кондуктометрические измерители, связанные с индикатором [1, 2] Однако, в данном случае они не позволяли получить достоверную информацию об иммунном состоянии организма, поскольку точность систем была недостаточно высокой и не имелась возможность оперативно оценивать состояние материала.

Наиболее близкой к заявленной является система, включающая сенсорный комплекс, блок датчиков, связанный с коммутируемым входом коммутатора, сигнальный выход которого подключен к измерительному генератору, причем, выход последнего связан со входом устройства управления и обработки сигнала, выход которого подключен к индикаторному табло [3]
В процессе работы такой системы регистрируется комплексная проводимость биологического материала, полученного в результате специфической подготовки, но процесс функционирования системы происходит так же недостаточно эффективно, без оптимальности и без необходимой стандартизации приемов подготовки материала несмотря на то, что осуществляется сравнение опытной и контрольной проб.

Также известен сенсорный комплекс, включающий сенсорную вставку, выполненную из пластика, на которой имеются выступы, сенсибилизированные диагностическими антителами, а также включающий маркер диагностических антител и соответствующий субстрат [4] Данный комплекс также наиболее близок по содержимому к заявленному.

Однако, в данном случае невозможно эффективно и многоразово использовать данную вставку с высокой степенью достоверности получаемого результата.

В процессе совместной работы вставки и системы регистрируется комплексная проводимость биологического материала, полученного в результате специфической подготовки, но процесс функционирования системы даже в такой совокупности происходит недостаточно эффективно, хотя при кондуктометрических измерениях имеется возможность осуществлять регистрацию с высокой точностью.

Целью данного изобретения является повышение избирательности и чувствительности в оценке реакций антитело-атиген исследуемых растворов, повышение удобства эксплуатации и улучшение эксплуатационных параметров.

Кондуктометрия основана на измерении электропроводности жидких электролитов, которая пропорциональна их концентрации. Поэтому, если получить конъюгаты антител с веществами, изменяющими электропроводность жидкостей, то таким образом можно изменять концентрации тел.

В константной области антител содержится углеродная часть. Это позволяет, не влияя на связывание, присоединять после окисления к углеродной части окрашенные, флуоресцентные маркеры, ферменты или полимерные носители.

В конъюгате в качестве антител использовали антитела против цитомегаловируса, а также другие антитела, а в качестве их маркера фермент нуклеинового обмена практическую дезоксирибонуклеазу 1, гидролизующую двух- или одноцепочную ДHК с образованием сложной смеси от моно- до олигонуклеотидов с 5-фосфатными кольцами.

В присутствии ионов М²⁺ ДHКаза 1 воздействует независимо на каждую цепь ДHК, при этом места разрывов располагаются случайным образом.

В качестве субстрата ДHКазы 1 использовали высокомолекулярную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДHК) (из молок лососевых рыб) с относительной молекулярной массой не менее 7•10⁶.

При воздействии конъюгата антител, например цитомегаловируса, и ДHКазы 1 на среду с субстратом (ДHК) должно происходить уменьшение вязкости среды и увеличение числа зараженных групп в пределе в два раза.

Наиболее часто встречающийся метод получения конъюгатов антител с ферментами периодатное окисление углеводной компоненты иммунноглобулина с последующим взаимодействием образующихся альдегидных групп с аминогруппами белков, приводящих к образованию оснований Шиффа. Преимущества метода в высокой реакционной способности альдегидных групп, недостаток в образовании в результате сшивок высокополимерных форм конъюгатов, характеризующихся различным мольным соотношением компонентов.

Поиск, проведенный по патентной и технической литературе показал, что заявленные совокупности неизвестны, т.е. они соответствуют условию патентоспособности "новизна".

Поскольку имеется потребность в такого рода устройствах и они выполняются из известных составляющих, то заявленное устройство соответствует условию "промышленная применимость".

А так как в результате использования заявленного устройства реализуется поставленная цель, причем такая реализация неочевидна для среднего уровня специалиста, то заваленное устройство соответствует условию "промышленная применимость".

На фиг. 1 представлена блок-схема системы; на фиг. 2 общий вид блока датчиков; на фиг. 3 вид лунок этих датчиков.

Иммунно-кондуктометрическая система включает блок датчиков 1, пусковое устройство 2, причем, блок датчиков 1 связан с коммутируемым входом коммутатора 3, сигнальный выход которого соединен с измерительным генератором 4, а управляющие вход и выход коммутатора 3 соединены с первым выходом и установочным входом пускового устройства 2, измерительный генератор 4, со входом которого связан сигнальный выход коммутатора 3, устройство управления и обработки сигнала, вход которого связан с выходом генератора 4 содержит опорный генератор 5 и программируемый делитель 6, выходы которых связаны с элементом сравнения 7, элемент И8, преобразователь 9, причем, выход элемента 7 связан с первым входом элемента И8, ко второму входу которого подключен второй выход пускового устройства 2, а выход элемента И8 связан со входом преобразователя 9, выход которого является выходом устройства управления и обработки сигнала и подключен ко входу индикаторного табло.

Блок датчиков 1 представляет собой обойму 11 с соответствующими лунками-емкостями 12 и 13 для контрольного и опытного образцов соответственно, контактные зоны 14 и 15 в этих емкостях посредством контактных дорожек 16 связаны с токосъемными зонами 17 и 18. Внутренние поверхности 19 лунок 12 и 13 выполнены ребристыми для увеличения контактной площади для сенсибилизированного реагента.

Для работы блок датчиков снабжается сенсорным комплексом, выполненным в виде сенсорной вставки в виде центрального стержня, в нижней части которого расположены равномерно по окружности ребра (не показано), причем поверхность ребер сенсибилизирована диагностическими антителами, в качестве маркера этих антител использована панкреатическая дезоксирибонуклеаза 1, а в качестве соответствующего субстрата в калибровочном растворе применена высокомолекулярная дезоксирибонуклеиновая кислота с относительной молекулярной массой более семи миллионов.

Имунно-кондуктометрическая система и сенсорный комплекс работают следующим образом.

Перед началом производят выбор конкретных сенсорных объектов для предполагаемой диагностики. Предварительно производят необходимую обработку, сенсибилизируют покрытие вставки и/или поверхности 19 лунок 12 и 13 тестовыми антителами, либо необходимыми реагентами. Производят подготовку исследуемых проб, разведение при этом может составлять доли миллионной части. Забор пробы осуществляют, например, в лунку 13, в лунку 12 помещают жидкость для контроля. Включают пусковое устройство 2. Разрешающие сигналы поступают на коммутатор 3 и схему И8. Программа работы коммутатора 3 включает возможность временного переключения с токосъемных зон 17 на токосъемные зоны 18 с соответствующей индикацией и возврат обратно. Время переключения порядка 15 секунд. Первые 15 секунд начала работы после пускового устройства 2 токосъемные зоны 17 датчика "контроль" через коммутатор 3 подсоединяются к измерительному генератору 4 и с учетом конкретного раствора устанавливают частоту генератора 4 в соответствии с величиной реактивной составляющей данного контрольного раствора. Измерительная частота, сформированная с помощью калибровочного раствора, выбранного конкретно к данной диагностике, через делитель 6 поступает на элемент 7, например, программируемый делитель, на второй вход которого подается частота с опорного генератора 5. Элемент сравнения 7, например, программируемый делитель или счетчик, а опорный генератор 5 выполнен аналогично генератору 4. Сигнал с элемента 7 поступает через элемент И8 на преобразователь 9 и далее на индикаторное табло 10, которое позволяет получить информацию о качестве анализируемой пробы и о количестве анализируемого компонента. Калибровочная проба датчика калибровки устанавливает для оператора либо в случае биохимического анализа, либо для иммунологической оценки реакции антитело-антиген, характеристику отрицательной реакции антитело-антиген. Через 15 секунд оценки калибровочного раствора коммутатор 3 производит подключение датчика "опыт" и процесс измерения повторяется с той лишь разницей, что индикаторное табло отображает информацию о количестве анализируемого вещества для анализа и качество реакции антитело-антиген для иммуннологической реакции антитело-атиген для иммуннологичческой реакции, характерной для исследуемой пробы. По истечение очередных 15 секунд оценки опыта коммутатор 3 вырабатывает сигнал для сброса пускового устройства 2. Процесс анализа в сравнении с калибровочной пробой закончен. Оператор получает информацию в одном случае - для иммунологической оценки положительная или отрицательная реакция в сравнении с контрольной отрицательной реакцией, или количество искомого компонента в случае биохимического анализа при предварительной калибровке анализатора раствором, содержащим искомый компонент. Для табло 10 вводятся поправочные коэффициенты в каждом конкретном случае анализа конкретного вещества, например, для оценки глюкозы в крови или моче, для оценки билирубина в крови и моче, для оценки нитратов и т.д.

Экспериментальная часть.

Пример 1. К раствору 24 мг антител к цитомегаловирусу (СМУ) в 4 мл воды (6 мг/мл) добавляли раствор 32 мг Na₂SO₄ в 4 мл воды (8 мг/мл) и выдерживали 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли для разложения периодата натрия 0,8 мл 10 водного этиленгликоля. Избыток низкомолекулярных компонентов удаляли диализом при 4^oС в воде в течение ночи. Конъюгат антител СМУ-ДHКаза 1 получали смешивая 8 мл раствора окисленных антител с 8мл (5 мг/мл) панкреатической ДHКазы 1 в 0,1М бикарбонатном буфере (рH 9,5). Реакционную смесь инкубировали ночь при 4^oС, затем проводили диализ против воды в течение суток. Образовавшийся конъюгат обрабатывали раствором NаВH₄ (4 мг/мл) в течение 1 ч на холоду. Далее диализовали против дистиллированной воды при 4^oС. Теорити-СМУ 3 мг/мл.

Таким образом, основная схема оценки диагностических антигенов выглядит следующим образом:
Субстрат
Ат + Аг + Ат(Ферм. + Метка)
Продукт.

Иммунно-кондуктометрический сенсор работает следующим образом.

Перед началом проведения диагностической оценки иммуннологической реакции антитело-антиген с использованием подготовленных сенсорных вставок, сенсибилизированных соответствующим диагностическими антителами (для оценки вирусных, бактериальных, паразитных или соматических заболеваний), получают известным путем или сыворотку крови пациента, или слюну, мочу, лимфу и т.д. в количестве 50 100 мкл и разводят эту биологическую жидкость до 10^-6 - 10 ^-9 либо физиологическим раствором, либо иммуннологическим буферным раствором.

В процессе оценки конкретной иммунной реакции, иммунно-кондуктометрический сенсор подразделяется на следующие этапы:
1. Узнавание антигена, т.е. сенсибилизированные на полистерольной вставке тестовые антитела помещаются в исследуемый раствор (сыворотка крови, моча, слюна), предварительно разведенный в 10^-6 раз. Раствор берется в объеме 200 мкл. Время нахождения сенсорной вставки в растворе 15 мин.

2. Отмывка сенсорной вставки в дистиллированной воде 1 мин.

3. Этап связи искомого антигена с тестовыми меченными антителами. После отмывки в дистиллированной воде сенсорную вставку помещают в лунку планшета с раствором меченных тестовых антител, т.е. сенсорная вставка (в случае наличия искомого антигена) выглядит следующим образом:
сенсибилизированные тестовые антитела + искомый антиген + меченные тестовые антитела (Ат + Аг + Ат.мет).

Время нахождения сенсорной вставки в растворе с меченными тестовыми антителами 15 мин. Затем сенсорную вставку отмывают в дистиллированной воде в течение 1 мин.

4. Этап обработки метки тестовых антител в калибровочном растворе.

Сенсорную вставку с "Ат + Аг + Ат.мет." помещают в лунку с калибровочным раствором на 3 5 мин. В этом растворе происходит химическая реакция метки с компонентами калибровочного раствора, что приводит к большим или меньшим (в зависимости от количества связанных меченных тестовых антител с искомым антигеном) изменениям электрических свойств калибровочного раствора.

5. Этап оценки изменений электрических свойств калибровочного раствора.

Из калибровочного раствора удаляется сенсорная вставка и помещается в слабый раствор уксусной кислоты на 1 мин, затем омывается в дистиллированной воде с целью удаления связки "Аг + Ат. мет." для дальнейшего использования этой сенсорной вставки в диагностике искомого антигена.

В свободную лунку (после сенсорной вставки) помещают кондуктометрический датчик и производят регистрацию полученных результатов. На табло прибора в зависимости от величины изменений электрических свойств калибровочного раствора, отнесенных к связке "Ат + Ат + Ат.мет.", привнесенной сенсорной вставкой в калибровочный раствор, фиксируется либо отрицательный результат три "минуса" (в случае отсутствия связки "Аг + Ат.мет."), либо от одного до трех "плюсов" в зависимости от количества связки "Ат + Аг + Ат. мет.".

Общее подготовительное время для разведения исследуемых растворов колеблется от 1,5 до 2,5 ч в зависимости от количества проб (до 50 проб) и подготовки лаборанта. Время анализа (получение конечного результата) 40 мин.

Таким образом общее время оценки 50 проб колеблется в пределах 2 ч.

Примеры проводимой оценки вируса герпеса и цитомегаловируса на базе института трансплантации органов и тканей (табл.1).

Оценка вируса герпеса проводилась на базе 1-ой ИКБ в сравнении с оценкой молекулярной гибридизации этих же проб сыворотки доноров. Оценка с помощью молекулярной гибридизации (зонды) проводилась на базе института Гамалеи (табл.2).

К положительным качествам иммунно-кондуктометрического сенсора, в сравнении с аналогом и прототипами, следует отнести следующее:
уменьшение влияния перекрестных реакций антитело-антиген за счет большого разведения (10^-6-10^-9) и использования сенсорной вставки, и, как следствие, повышение иммунной избирательности;
увеличение чувствительности (от 100 до единиц пиктограмм диагностируемого антигена) за счет использования больших разведений и кондуктометрической оценки калибровочного раствора (это хорошо видно в сравнении с данными молекулярной гибридизации в оценке герпеса);
использование малого количества дорогостоящего тестового материала (диагностических антител) в сенсибилизации сенсоров, многократность использования сенсорных вставок;
малое время получения конечного результата (2 ч по 50 проб С увеличением количества проб, время увеличения увеличивается только за счет опытности и профессионализма лаборанта);
доступность и простота использования иммунно-кондуктометрического сенсора;
технологичность, дешевизна получения сенсорных вставок.

Источники информации:
1. Патент США N 5082550, кл. G 01 N 27/00, 1992 г.

2. Патент РФ N 2027174, кл. G 01 N 27/02, 1995 г.

3. Заявка Франции N 2598227, кл. G 01 N 33/53, 1987 г.

4. Патент США N 4977078, кл. G 01 N 33/53, 1990 г.

Использование: средства определения состояния и классификации биологического материала. Сущность изобретения: блок датчиков заполняют опытным и контрольным образцами. При помощи коммутатора образцы подключаются к измерительному генератору, преобразованный сигнал с которого сравнивается с сигналом с опорного генератора. Информация о частотных изменениях характеризует изменение реактивной составляющей растворов. На основании сравнения параметров исследуемого раствора с контрольным имеется возможность проведения как иммунной, так и биохимической диагностики. 2 с.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Иммуннокондуктометрическая система, включающая сенсорный комплекс, блок датчиков, связанный с коммутируемым входом коммутатора, сигнальный выход которого подключен к измерительному генератору, причем выход последнего связан с входом устройства управления и обработки сигнала, выход которого подключен к индикаторному табло, отличающаяся тем, что устройство управления и обработки сигнала выполнено в виде пускового устройства, схемы И, преобразователя, а также программируемого делителя, вход которого является входом устройства управления и обработки сигнала, и опорного генератора, причем выходы двух последних связаны с соответствующими входами элемента сравнения, выход которого и первый выход пускового устройства подключены к входам схемы И, выход последней связан с входом преобразователя, выход которого является выходом устройства управления и обработки сигнала, кроме того, второй выход пускового устройства связан с управляющим входом коммутатора, управляющий выход которого подключен к установочному входу пускового устройства. 2. Сенсорный комплекс, включающий сенсорную вставку, выполненную из пластика и содержащую выступы, поверхность которых сенсибилизирована диагностическими антителами, маркер диагностических антител и соответствующий субстрат, отличающийся тем, что вставка выполнена в виде центрального стержня, в нижней части которого расположены ребра и соседние из них установлены с постоянным угловым смещением друг относительно друга, в качестве маркера диагностических антител применена панкреатическая дезоксирибонуклеаза 1, а в качестве соответствующего субстрата в калибровочном растворе применена высокомолекулярная дезоксирибонуклеиновая кислота с относительной молекулярной массой более семи миллионов.