Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике вируса гепатита В. Гепатит В является тяжелым инфекционным заболеванием человека. HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) - основной маркер заболевания, подтверждающий наличие острой или хронической формы инфекции или носительства. Для создания тест-систем для диагностики гепатита В необходимо наличие моноклональных антител к HBsAg.
Ряд авторов [1,5] получили коллекции гибридом, продуцирующих МКА (моноклональные антитела) к HBsAg. Однако, только немногие из штаммов обладают свойствами, необходимыми для штаммов-продуцентов, пригодных в производстве диагностических тест-систем: высокими ростовыми характеристиками, большим выходом антител на мышь в асцитной жидкости, стабильностью продуцируемых антител в растворе с сорбированными на твердой фазе, высокой активностью в реакции антиген-антитело, специфичностью к определенному участку "а" антигенной детерминанты и главное способностью выявлять HBsAg в низких концентрациях [3,4]
Известно, что группоспецифическая а-детерминанта молекулы HBsAg является сложной и содержит несколько сайтов связывания антител [6] Наличие МКА к различным сайтам на а-детерминанте молекулы HBsAg могло бы позволить конструировать диагностикумы по двухсайтному методу, в котором взаимодействие иммуноспецифических реагентов проводится в одну стадию, используя независимость связывания МКА с разными эпитопами. При конструировании тест-систем по двухсайтному методу можно добиваться более высокой чувствительности [3]
Наиболее близкой к заявляемой является гибридома ЖАК-22. Она обладает следующими свойствами: титр асцитной жидкости в ИФА 4•105, содержание специфических антител 9,7 мг/мл, чувствительность при определении HBsAg и РИА 2 нг/мл, в ИФА 1 нг/мл [1,2]
По сравнению с ЖАК-22 HBSV-1 отличается большим выходом асцитной жидкости на мышь, более высокими титрами асцитной жидкости в ИФА и более высокой чувствительностью при определении HBsAg.
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела к определенному сайту группоспецифической а-детерминанты HBsAg.
Цель достигается получением коллекции гибридом, продуцирующих МКА к HBsAg (по реакции в ИФА) и состоящей из 50-ти различных клонов. Гибридомы сравниваются по ростовым характеристикам, стабильности продукции антител, прививаемости мышам сингенной линии, объему получаемых асцитных жидкостей, титрам антител асцитных и культуральных жидкостей в разных вариантах ИФА, а также в РПГА и иммунодиффузии. Продуцируемые гибридомами антитела сравнивают также в реакции конкурентного ИФА, что позволяет разделить их на несколько групп конкуренции. Реакция с adw и ayw генноинженерными вариантами HBsAg позволяет определить МКА комплементарные а-детерминанте молекулы HBsAg.
В результате анализа был отобран штамм, комплементарный определенному участку а-детерминанты HBsAg и обладающий хорошими характеристиками штамма-продуцента МКА.
Гибридомы получают слиянием клеток миеломы PЗ-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HBsAg. Мышь линии BALB/c (самка, 8 недель) иммунизируют внутрибрюшинно HBsAg, выделенным из плазмы сыворотки хронически больных людей, в количестве 20 мкг в 0,5 мл забуференного фосфатом физраствора (ЗФР), содержащего 50% полного адъюванта Фрейда и через 8 недель 200 мкг HBsAg в 0,5 мл ЗФР внутрибрюшинно. Через 3 дня после второй иммунизации клетки селезенки иммунной мыши гибридизируют с клетками миеломы мыши РЗ-NS1-Ag4-1 (соотношение 3: 1) в 1 мл раствора, содержащего 50% полиэтиленгликоля (м.м. 4000 "Merk") и 5% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные планшеты по 3•105 клеток на лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду ДМЕМ (м) с добавлением 10% телячьей эмбриональном сыворотки, 4•10-7М аминоптерина, 10-4M гипоксантина и 1,6•10-5M тимидина. Гибриды-продуценты отбирают методом иммуноферментного анализа (ИФА) и дважды клонируют методом лимитирующих разведений.
Продуктивный штамм обозначен HBSV-1.
Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 30.11.93 под номером ВСКК/П/630 Д. Штамм депонирован с научным списанием (паспортом).
Штамм характеризуется следующими признаками.
Родословная штамма.
Гибридома получена слиянием клеток миеломы РЗ-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HBsAg, с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 4000). Селекцию гибридов проводили на НАТ среде. Клетки были дважды клонированы, процент позитивных клонов после 2-го клонирования 100% К моменту депонирования число пассажей 40.
Культуральные свойства.
Среда для культивирования среда ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 40 мкг/мл гентамицина при 37oC и 5% CO2. Гибридомы культивируются в стеклянных или пластиковых флаконах объемом 0,05-1,5 л в стационарном состоянии, клетки снимаются смесью растворов трипсина (25 мкг/л) и Версена в соотношении 1:2, посевная доза 150 тыс. клеток в мл, кратность пересева 1:4 или 1:5, время субкультивирования 2-3 суток.
Культивирование гибридомы в организме животного.
Гибридома может быть культивирована в организме мышей линии BALB/c, сенсибилизированных внутрибрюшинно за 5-40 дней 0,5 мл пристана или вазелинового масла. Доза клеток при прививке 1-10•106. Асцит образуется через 7-18 дней. Гибридома может перевиваться.
Морфологические признаки.
Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой РЗ-NS1-Ag4-1.
Данные о видовой принадлежности.
Гибридома является мышиной получена слиянием клеток мышиной миеломы и спленоцитов мыши, может культивироваться в организме мыши, секретируемые ею МКА взаимодействуют с антисывороткой к иммуноглобулинам мыши.
Маркерные признаки и методы их оценки.
Гибридома представляет собой монослойно-суспензионную культуру клеток и продуцирует антитела со следующими маркерными признаками-антитела принадлежат к классу IgG1, слабо взаимодействует с белком А золотистого стафилококка (по данным ИФА и аффинной хромотографии), реагируют в ИФА с HBs-антигеном плазматическим, HBs-антигеном генноженерным adw и ayw серотипов, дают положительный ответ в реакции диффузной преципитации в геле, РПГА и в "сэндвич"-варианте ИФА, взаимодействуя одновременно с HBsAg, сорбированном на твердой фазе, и с HBsAg, конъюгированном с пероксидазой и находящемся в растворе.
Данные о контаминации.
Бактерии и грибы не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился.
Характеристика биосинтеза полезных продуктов.
Секретируемые гибридомой МКА имеют титр около 1•10-3 в культуральной жидкости, 1•10-6 в асцитной жидкости (по данным ИФА), стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 40 пассажей в культуре клеток (срок наблюдения).
Способ криоконсервации.
Клетки замораживаются на ростовой среде с 40%-ной фетальной сывороткой теленка и 10%-ным диметилсульфоксидом при минут 70oC в пенопластовом контейнере с толщиной стенок 1,5см в течение ночи, хранятся в жидком азоте, размораживаются в течение 1-2 мин при 37-40oC, отмываются от криозащитной среды и культивируются на ростовой среде в стеклянных или пластиковых флаконах; выживаемость клеток при размораживании составляет 70-80% (по окраске трипановым синим).
На чертеже приведены кривые конкуренций клонов ЖАК-22 и HBSV-1: на оси абцисс номер трехкратного разведения конкурента, конкурентом в реакции являются МКА HBSV-1 из культуральной жидкости; меченые антитела МКА HBSV-1 (1) и ЖАК-22 (2).
Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения.
Пример 1. Определение специфической активности антител.
HBsAg из плазмы больных людей или генноинженерный avw серотипа сорбируют в лунки полистироловых планшетов из раствора ЗФР, содержащего антиген в концентрации 10 мкг/мл, в течение ночи; неспецифические места связывания на пластике блокируют с помощью 0,1%-ного раствора казеина в ЗФР, проводят титрование культуральной асцитной жидкости с разведения 1/30 с кратностью 3 в блокирующем буфере; время реакции антиген-антитело ночь при комнатной температуре; после отмывки в лунки добавляют антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена [7] После окончания инкубации (1ч и 37oC) несвязавшиеся продукты реакции отмывают и связавшийся конъюгат определяют количественно по расщеплению субстрата (H2O2) в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Титром считаются разведение раствора антител, при котором наблюдалось оптическое поглощение 0,2 о.е./мл при длине волны 492 нм.
При реакции с плазматическим HBsAg титры в культуральной жидкости составляют примерно 10-3, титры асцитной жидкости составляют примерно 10-6. Соотношение титров при реакции с HBsAg плазматическим и генноинженерным ayw серотипа 1:3.
Пример 2. Реакция МКА HBSV-1 с разными серотипами HBsAg. При сравнении реакции МКА с разными серотипами генноинженерного HBsAg (adw и ayw) антитела из раствора ЗФР, с концентрацией 10 мкг/мл, сорбируют в лунках полистироловых планшетов, блокируют 0,1%-ным раствором казеина и добавляют adw и ayw варианты генноинженерного HBsAg в блокирующем буфере с концентрацией от 100 до 1,3 нг/мл с кратностью разведений 3. МКА для сорбции очищают с помощью аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка [8] Реакцию антиген-антитело ведут в течение ночи при комнатной температуре. После отмывки добавляют МКА HBSV-1, конъюгированные с пероксидазой хрена, на 1 ч при 37oC. Положительную реакцию определяют как описано выше, МКА HBSV-1 реагируют как с adw, так и с avw серотипами генноинженерного HBsAg с соотношением титров 1:1.
Пример 3. Проведение конкурентного ИФА.
Метод основан на конкуренции между мечеными пероксидазой хрена и немечеными МКА при ограниченной концентрации антигена. Конъюганты МКА получают периодатным методом [7] В лунки полистироловых планшетов с сорбированным HBsAg добавляют конкурирующие антитела в серии 3- кратных разведений и инкубируют 2 ч при 43oC, после чего вносят меченые МКА на 2 ч при 43oC. Разведение меченых МКА подбирают так, чтобы они в отсутствие конкурента давали в ИФА значение экстинкции на 492 нм 1 о.е./мл. Количество связавшейся метки определяют, как описано выше. Процент конкуренции вычисляют по формуле:
где А величина связывания метки в отсутствие конкурента,
В связывание метки в присутствии немеченного МКА.
Связывание МКА HBSV-1, меченного пероксидазой хрена, с HBsAg подавляется немеченными МКА HBSV-1 и ЖАК-22. Таким образом МКА ЖАК-22 и HBSV-1 относятся к одной группе конкуренции и конкурируют между собой за сайт связывания на молекуле HBsAg.
Пример 4. Определение стабильности МКА в растворах. Стабильность МКА определяют по соотношению титров в ИФА культуральных и асцитных жидкостей после их обработки следующими способами: прогрев при 37oC в течение 43 ч, прогрев при 60oC в течение 1 ч, трехкратная заморозка и разморозка. Показано, что при всех методах обработки титры специфических антител, определенные методом ИФА, в культуральной и асцитной жидкости не меняются.
Пример 5. Определение HBsAg в растворах.
МКА HBSV-1, очищенные методом аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка, конъюгируют с пероксидазой хрена. В лунках полистироловых планшетов сорбируют очищенные МКА HBSV-1 из раствора ЗФР, содержащего МКА в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи; места неспецифического связывания блокируют 0,1%-ным раствором казеина в ЗФР, отмывают трижды водой и добавляют HBsAg в серии 3-кратных разведений в концентрации от 100 нг до 0,01нг в объеме 100 мкл и конъюгат МКА HBSV-1 с пероксидазой хрена в разведении 1/1000 в объеме 50 мкл на 3 ч при 43oC. Реакцию проявляют, как описано выше. Положительной считают реакцию, когда значение экстинкции на 492 нм превышает значение экстинкции для контрольной лунки (без HBsAg) на 0,04 о.е. Метод позволяет определять до 0,3нг/мл HBsAg в растворе.
Штамм отличается от других близких штаммов следующей совокупностью признаков: продуцируемые им МКА реагируют в ИФА со следующими вариантами HBsAg: плазматическим из сыворотки переболевших людей, генноинженерными осповакцинными серотипов adw и ayw; конкурируют за сайт связывания на молекуле HBsAg с МКА ЖАК-22; не связываются с HBsAg, денатурированным 2-меркаптоэтанолом, следовательно, МКА комплементарны конформационному эпитопу на группоспецифической "а" антигенной детерминанте молекулы HBsAg (этот участок а-детерминанты молекулы HBsAg обозначается как А); МКА относятся к 1gG1; могут быть очищены с помощью аффинной хромотографии на белке А золотистого стафилококка с высоким выходом (98%), обладают высокой стабильностью при хранении в растворах и сорбированными на пластике; клетки обладают отличными ростовыми характеристиками, стабильны по продукции МКА (срок наблюдения около 40 пассажей), хорошо прививаются животным и дают большой выход асцитной жидкости на мышь (4-10 мл) с высоким содержанием специфических антител (5-10 мг/мл) и с высокими титрами специфических антител в ИФА (105-106); МКА пригодны для выявления HBsAg в растворах, сыворотке людей и сорбированного на пластике.
Перечисленные свойства позволяют использовать штамм HBSV-1 для производства диагностических тест-систем.
Список литературы:
1. Кущ А.А. Момот А.М. Шумай Е.П. и др.
Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B. Вопросы вирусологии, 1987, N4, с. 448-451.
2. Жданов Е.М. Кущ А.А. Момот А.М. и др.
Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, N12, с.37-40.
3. Кущ А.А. Момот А.М. и др.
Сравнение различных тест-систем для радиоиммунологического определения поверхностного антигена вируса гепатита B с использованием моноклональных антител. Вопросы вирусологии, 1987, N5, с. 544-548.
4. Воробьев С.М. Симонов В.И. Кущ А.А.
Использование моноклональных антител для иммуноферментного определения поверхностного антигена вируса гепатита В. Биотехнология, 1987, N6, с. 720-724.
5. Wands J.R. Zurawski V.R.
HIgh affinity monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen, produced by somatio cell hybrids.
Gastroenterology, 1981, v. 80, p. 225-232.
6. Wands et al.
Signature analisis of hepatitis B viral antigen structure: analisis by monoclonal radioimmunoassays.
PNAS USA, 1984, v. 81, p. 2237-2241.
7. Nakane P.K. and Kawaoi,
Histochem. Cytochem. 1974 y. v. 22, p. 1084.
8. Ey P.L. et a1.
Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose.
Immunochemistry, 1978, v. 15, p. 429-436.
Использование: разработка биотехнологических методов диагностики гепатита В. Сущность: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши HBSV-I, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к а-детерминанте поверхностного антигена вируса гепатита В(НВsAg). Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗ-NS1-Ag4.1 с клетками селезенки мышей линии ВаLb/c, иммунизированных поверхностным антигеном вируса гепатита В, выделенным из сыворотки крови хронически больных гепатитом. Полученный штамм продуцирует МКА IgGI, взаимодействующие с конформационным эпитопом на группоспецифической а-детерминанте НВsAg и обладающие высокой стабильностью. МКА позволяют выявлять HBsAg в растворах и биологических жидкостях организма. 1 ил.
Штамм гибридных культивируемых клеток животного Mus musculus L ВСКК(П) N 630Д продуцент моноклональных антител к a-детерминанте поверхностного антигена вируса гепатита B.
| Кущ А.А., Момот А.М., Шумай Е.П | |||
| и др | |||
| Вопросы вирусологии, 1987, N 4, с | |||
| Корнерез для пней | 1921 |
|
SU448A1 |
