СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЛЕКАРСТВА В РАКОВУЮ КЛЕТКУ Российский патент 1997 года по МПК A61K38/17 A61K38/17 A61K31/19 A61K31/335 

Изобретение относится к области медицины и в частности онкологии.

Известен способ получения препарата для направленной доставки противоопухолевых лекарств в раковую клетку, включающий измельчение абортивного материала человека, экстракцию бутиловым спиртом, диализ против 0,05 М раствора NaCl, концентрирование до содержания альфа-фетопротеина 100 Мкг/мг стерилизацию и прединкубацию стерилизованного продукта с 20 мг конъюгата доксорубицин-эстрон за 1-2 ч, до внутривенного введения препарата (патент RU N 2026688, A 61 K 38/00, 1995).

Недостатком способа является то, что известный препарат не подлежит хранению более 2 ч.

Известен также способ получения для направленной доставки противоопухолевых лекарств в раковую клетку, включающий смешение сыворотки из пуповинной крови человека, предварительно подвергнутой фильтрации, центрифугированию и стерилизации, с конъюгатом доксорубицинарахидоновая кислота, при этом смешение проводят из расчета до 8 мг альфа-фетопротеина сыворотки с 20 мг конъюгата за 1-2 ч до внутривенного введения (патент RU N 2026687, A 61 K 38/00, 1995).

Недостатком способа также является невозможность хранения препарата более 2 ч, а также недостаточная степень его чистоты.

Задача изобретения создание лекарственного средства высокой степени чистоты и подлежащего хранению длительное время.

Поставленная задача решается описываемым способом получения лекарственного средства для направленной доставки противоопухолевых лекарств в раковую клетку, включающим конъюгацию противоопухолевого лекарственного вещества с арахидоновой кислотой, смешение конъюгата с обезжиренным раствором альфа-фетопротеина в физиологическом растворе при массовом соотношении конъюгата к альфа-фетопротеину равном 1:(1-2), выдержку смеси при 4^oC±0,5, фильтрацию и замораживание.

При этом рекомендуется использовать альфа-фетопротеин, выделенный из абортальной или плацентарной сыворотки или пуповинной крови путем двух ступенчатой афинной хроматографии, вначале на иммуносорбенте с иммобилизованными моноспецифическими к альфа-фетопротеину антителами, а затем на сорбенте с иммобилизованными полиспецифическими антителами к балластным белкам.

Предпочтительно, выдерживать смесь при 4^oC±5 в течение 10-12 ч, или смесь замораживать и выдерживать для хранения до минус 30^oC. В качестве противоопухолевых лекарственных веществ рекомендованы эпирубицин, адриамицин, доксорубицин.

Предпочтительно проводить конъюгацию противоопухолевых лекарственных веществ с арахидоновой кислотой при их мольном соотношении 1:(1-1,5).

Пример. Выделение альфа-фетопротеина (АФП) из абортальной или плацентарной сыворотки или пуповинной крови проводят следующим образом.

Сыворотку, например, абортальной крови подают на хроматографическую колонку, заполненную сефарозой с иммобилизованными кроличьими моноспецифическими к АФП антителами. Далее колонку элюируют раствором Na₂CO₃ и элюат подают на вторую хроматографическую колонку, заполненную софарозой иммобилизованной кроличьими полиспецифическими антителами к балластным белкам. Таким образом получают альфа-фетопротеин с 98%-ной чистотой.

Получение конъюгата противоопухолевого лекарственного вещества с арахидоновой кислотой проводят следующим образом.

Хлорангидрид арахидоновой кислоты растворяют в 1 мл сухого бензола, добавляют суспензию эпирубицина (1,5 моль) в том же растворителе и перемешивают встряхиванием в течение 6-8 ч при комнатной температуре.

Непрореагировавший эпирубицин экстрагируют 0,001 N раствором соляной кислоты. Органический слой отделяют на делительной воронке и упаривают на роторном испарителе и сушат под вакуумом до постоянного веса.

Получен конъюгат с мольным соотношением эпирубицин:арахидоновая кислота 1:1.

Получение комплекса конъюгата с АФП (альфа-фетопротеин). Один мг конъюгата суспендируют в 0,2 мл этанола, отбирают 20 мкл и прибавляют к предварительно обезжиренному раствору АФП (1 мг в 1 мл физраствора), тщательно перемешивают и оставляют на ночь при 4^oC. Далее раствор фильтруют и замораживают для хранения (-30^oC). Массовое соотношение конъюгата к АФП 1:1.

Аналогичным образом получены лекарственные средства: альфа-фетопротеин с конъюгатами арахидоновой кислоты с адриамицином, доксорубицином и некоторыми другими антрациклиновыми антибиотиками, имеющими первичную аминогруппу, при мольном отношении конъюгата к альфе-фетопротеину 1:1 и 1:2.

Все полученные средства отличаются высокой степенью чистоты не менее 99% поскольку предложенный способ предусматривает использование чистого альфа-фетопротеина (≈98% чистоты).

Срок хранения полученных лекарственных средств составляет не менее 1 мес, что позволяет избежать их приготовления за 1-2 ч перед введением.

Оценка цитотоксических эффектов полученных средств: конъюгатов альфа-фетопротеина с арахидоновой кислотой и некоторых из исследованных противоопухолевых лекарств проведена in vitro. В качестве модели использована культура клеток карциномы яичника человека (линия CaOv).

Соединение считают цитотоксичным при CE50 1•10^-4 M. CE вычисляли методом проб и анализа.

Цитотоксическое действие лекарственных средств АФП с конъюгатами противоопухолевых лекарственных веществ и арахидоновой кислоты относительно клеток культуры карциномы яичника человека.

Из таблицы видно, что цитотоксичность лекарственных средств достаточно высока.

Проведено сравнение полученных препаратов с препаратами, полученными по способу-прототипу.

Обнаружено, что их цитототоксическая активность находится на одном уровне, CE50 1•10^-9 M, однако, срок хранения средств, полученных предложенным способом значительно выше.

Использование: в области медицины. Сущность изобретения: смешивают обезжиренный раствор α-фетопротеина в физиологическом растворе с противоопухолевым лекарственным веществом и арахидоновой кислотой, выдерживают смесь при 4^oC±0,5, фильтруют и замораживают. α-фетопротеин предпочтительно выделяют из биологического материала путем 2-х ступенчатой афинной хроматографии на иммуносорбентах. 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения лекарственного средства для направленной доставки противооопухолевого лекарственного вещества в раковую клетку, включающий конъюгацию противоопухолевого лекарственного вещества с арахидоновой кислотой и смешение полученного конъюгата с раствором, содержащим альфа-фетопротеин, отличающийся тем, что на смешение подают обезжиренный раствор альфа-фетопротеина в физиологическом растворе при массовом соотношении конъюгата и альфа-фетопротеина 1 1 2, после смешения смесь выдерживают при 4 ± 0,5^oC, фильтруют и замораживают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют альфа-фетопротеин, выделенный из абортальной или плацентарной сыворотки или пуповинной крови путем двуухступенчатой аффинной хроматографии сначала на иммуносорбенте с иммобилизованными моноспецифическими к альфа-фетопротеину антителами, а затем на иммунносорбенте с иммобилизованными полиспецифическими антителами к балластным белкам. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь выдерживают при (4 ± 5)^oC в течение 10 12 ч. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что смесь замораживают до -30^oС и выдерживают при данной температуре. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве противоопухолевого лекарственного вещества используют эпирубицин, или адриамицин, или доксорубицин. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что конъюгацию противоопухолевого лекарственного вещества с арахидоновой кислотой проводят при их молярном соотношении 1 1 1,5.