БИОСЕНСОР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ВОДЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/18 C12Q1/02 

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, в частности к разработке биосенсоров для определения поверхностно-активных веществ в водных растворах с использованием микроорганизмов и ферментов и может быть применено в медицине, санитарной гигиене, охране окружающей среды для быстрого обнаружения и анализа низких концентраций синтетических поверхностно-активных веществ /СПАВ/.

Известные в настоящее время методы определения СПАВ обладают низкой чувствительностью, малой селективностью, трудоемки из-за необходимости операций экстракции, осаждения и др. связаны с использованием токсичных веществ. Предлагаемый биосенсор для определения низких концентраций СПАВ позволяет повысить чувствительность определения СПАВ, значительно сократить время анализа, избежать трудоемких операций и контакта с вредными веществами.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения антибиотической активности препаратов, в котором в качестве тест-организма используется периодическая культура бактерий Photobacterium leiognathi в стадии нарастания интенсивности свечения клеток, а активность антибиотиков определяется по изменению интенсивности свечения после их добавления в культурную пробу.

Недостатками этого способа, не позволяющими использовать его для быстрого определения низких концентраций СПАВ, являются: длительность операций по подготовке тест-системы к анализу и отсутствие чувствительности культуры бактерий Ph. leiognathi к аморфным СПАВ типа N-окиси третичного амина.

Целью данного изобретения является разработка биосенсора для быстрого и чувствительного определения низких концентраций СПАВ в водных растворах.

Поставленная цель достигается благодаря тому, что в качестве тест-организма в предлагаемом биосенсоре используется культура бактерий Photobacterium fischeri с высоким стабильным уровнем свечения, количество СПАВ определяется по изменению интенсивности свечения после добавления вещества в пробу культуры, а в качестве СПАВ применены амфотерные соединения типа N-окиси третичного амина.

Сущность предлагаемого биосенсора для определения низких концентраций СПАВ заключается в следующем. Культуру Ph. fischeri выращивают на твердой полусинтетической среде при 24^oC в течение 22 ч до достижения высокой стабильной интенсивности свечения, смывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером /pH 7,4/, готовят суспензию бактерий в концентрации 10⁷ кл/мл, разливают в кюветы люминометра по 0,5 мл и определяют интенсивность свечения исходной тест-системы I₀. Для нахождения концентрационной зависимости действия вещества готовят ряд разведений СПАВ. По 5 мкл каждого разведения СПАВ добавляют в соответствующую исходную пробу культуры не менее чем в трех повторениях. Полученный ряд проб с СПАВ и контрольный образец тестовой системы помещают в кювету люминометра и регистрируют изменение свечения в течение 15-20 мин.

Эффективность влияния каждого из исследуемых разведений СПАВ определяют по изменению интенсивности свечения культуры как отношение I_t/I₀ в процентах. Для каждого разведения строят график зависимости I_t=f/t/. В течение опыта свечения контрольного образца остается постоянным, а зависимость I_t= f/t/ для t=15-20 мин при измерении СПАВ имеет практически линейный характер, что позволяет проводить измерения низких концентраций СПАВ с высокой степенью точности. Достоверным считают изменение интенсивности свечения в пробе на 10% и более от исходного, контрольного образца.

Пример 1. Культуру Ph. fischeri выращивают на твердой питательной среде при 24^oC в течение 22 ч, смывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером, приготавливают суспензию клеток 5,0•10₇ кл/мл. Разливают по 0,5 мл суспензии в кюветы, измеряют исходное свечение I₀. Готовят ряд разведений амфолита /дезинтегрона-O/ СПАВ 0-14: 1,8•10^-5M, 2,4•10^-5M, 3,0•10^-5M.3,0•10^-4M. По 5 мкл каждого разведения добавляют в соответствующую пробу; полученный ряд разведений и контрольный образец помещают в люминометр, измеряют изменение интенсивности свечения в течение 15 мин. Для каждого разведения дезинтегрона-O /в 3-х повторениях/ определяют отношение I_t/I₀ в процентах, находят среднее значение. Результаты представлены в табл. 1. По этим данным строят калибровочные графики для определения низких концентраций СПАВ. В течение анализа изменения интенсивности свечения тестовой культуры в диапазоне измеряемых концентраций дезинтенгрона-O: 2,0•10^-5M - 3,0•10^-4M наносят линейный характер, что позволяет с высокой точностью определять низкие концентрации детергента. Для определения СПАВ 0-14, превышающих 3,0•10^-4M, длительность измерений сокращают из-за быстрого ответа сенсора. Чувствительность определения дезинтегрона-O с помощью данного сенсора составляет 2,0•10^-5M, средняя относительная ошибка измерений -5% быстрота ответа сенсора позволяет производить более ста анализов СПАВ в час.

Пример 2. Суспензию клеток Ph.fischeri, плотностью 5•10⁷ кл/мл готовят как описано в примере 1, а амфолитные СПАВ берут с различной длиной радикала. Разливают в кюветы по 0,5 мл суспензии, измеряют исходное свечение I₀. Готовят разведения 3,0•10^-4M ряда амфолитов типа N-окиси третичного амина с различной длиной гидрофобного радикала и по 5,0 мкл раствора каждого соединения добавляют к соответствующей пробе. Изменение интенсивности свечения определяют в течение 15 мин, находят отношение I_t/I₀ в процентах, результаты представлены в табл. 2, и строят калибровочные графики для определения данного амфолита.

Средняя относительная ошибка при определении амфолитов с разной длиной радикала при концентрации детергента 3,0•10^-4M составляет 5% С помощью данного сенсора в течение часа можно провести анализ более 30 различных амфолитов при действующей на сенсорную систему концентрации СПАВ.

Пример 3. Суспензию клеток готовят как описано в предыдущих примерах 1, 2 и измеряют свечение исходных образцов I₀. По 0,5 мкл раствора дезинтегрона-О заданной концентрации, например, 3,0•10^-5M и 3,0•10^-4M добавляют в трех повторах в соответствующие пробы и измеряют изменение интенсивности свечения в процентах от исходного уровня биолюминесценции, результаты представлены в табл. 3, и по средним значениям строят калибровочные графики для соответствующих концентраций СПАВ. Предлагаемый биосенсор, как видно из табл. 3, позволяет с высокой степенью точности строить концентрационные графики амфолитных СПАВ в пределах разведения детергента 3,0•10^-5M 3,0•10^-4M. Достигнутая с помощью данного сенсора точность тестирования СПАВ позволяет определять разные концентрации детергентов и использовать биосенсор также для анализа степени чистоты применяемого СПАВ.

Таким образом, предлагаемый биосенсор для определения СПАВ позволяет быстро, с высокой степенью точности определять низкие концентрации амфолитов типа N-окиси третичного амина в водных растворах, определять амфолиты с различной длиной гидрофобного радикала и строить калибровочные графики определенных низких концентраций данных соединений для определения их химической чистоты. Диапазон определяемых с помощью биосенсора концентраций амфолитных СПАВ составляет 10^-5M 10⁴M, средняя относительная ошибка измерений 5% Сенсор позволяет проводить до 100 измерений в час прост в употреблении, автоматизирован, обработка данных возможна с помощью сопряжений с люминометром ЭВМ.

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, в частности к разработке биосенсоров для определения поверхностно-активных веществ в водных растворах с использованием микроорганизмов и ферментов. Преимущественной областью использования является медицина, санитарная гигиена, охрана окружающей среды. Цель изобретения - разработка высокочувствительного и специфического биосенсора для определения амфолитных СПАВ. Биосенсор представляет собой культуру бактерий Photobacterium fischeri, которая изменяет интенсивность биолюминесценции при добавлении СПАВ в подготовленную пробу культуры. Биосенсор позволяет быстро, с высокой степенью точности определять концентрации 10^-5 M - 10^-4 M амфолитных СПАВ. 3 табл.

Применение бактерий Photobacterium fischeri в качестве биосенсора для количественного определения синтетических поверхностно-активных веществ в воде.