ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio fischeri, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам бактерий для биотестирования токсичности объектов окружающей среды и может быть использовано при проведении эколого-токсических исследований, при мониторинге водных экосистем.

Известен штамм бактерий Ph. phosphoreum (Cohn) Ford, который рекомендован для биотестирования воды на территории Украины (1)(2). Недостаток штамма заключается в том, что при проведении тестирования он используется в лиофилизированном виде и требуется восстановление его активной формы. Кроме того, чувствительность данного штамма к токсическим веществам недостаточно высокая, в частности, известный штамм позволяет определить наличие токсических веществ в концентрациях, превышающих ПДК.

Известен, выбранный в качестве прототипа, бактериальный тест «Эколюм», разработанный в России (МГУ, Москва) (3). Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры генно-инженерного штамма люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Культура получена посредством генно-инженерного внедрения lux-оперона в специально подобранный штамм Е. coli. Производится согласно ТУ 6-09-20-236-93.(3) Используется для определения токсичности воды, почв (4), почв (5), химических соединений, полимеров, материалов и изделий (6).

Биотестирование основано на определении изменения интенсивности биолюминесценции биосенсора «Эколюм» при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Недостатком известного штамма является недостаточно высокая чувствительность к токсическим веществам, в частности, к их наличию в концентрациях на уровне ПДК и ниже. Для тестирования используется лиофилизированная культура, которая находится в биологически неактивной форме, и для перехода к активному физиологическому состоянию ей требуется время для прохождения нескольких делений клеток. Недостатком следует считать и высокую себестоимость производства биосенсора вследствие использования дорогостоящего процесса лиофилизации. Кроме того, препарат биосенсора поставляется лишь при условии изначального приобретения прибора экологического контроля «Биотоке-10М».

Целью данного изобретения является получение нового, доступного и дешевого штамма бактерий, характеризующегося высокой чувствительностью биолюминесценции к действию токсических веществ самой разнообразной химической природы.

Для достижения поставленной цели предложен штамм бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9580, выделенный из воды Черного моря, отобранной в районе м. Б.Утриш (справка о депонировании прилагается)

Для выделения штамма биолюминесцентных бактерий из морской воды использовали метод мембранных фильтров. Бактерии концентрировали из анализируемой воды на мембранный фильтр и затем выращивали их на селективных средах для светящихся бактерий. Выделение биолюминесцентных бактерий проводили, визуально анализируя наличие биолюминесценции. При обнаружении люминесценции выделяли чистую культуру бактерий стандартными методами.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Bergey (Определитель бактерий Берджи. Т.1 / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, С.Уильямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.; Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж.Хоулта. - М.: Мир, 1980. - 496 с.). Для окончательного установления вида штамма выполнена идентификация по генетическим характеристикам во ФГУП «ГосНИИГенетика», ВКПМ. Определение проводили по результатам анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК. По результатам проведенного анализа тестируемый штамм микроорганизм относится к виду Vibrio fischeri (гомология 99%).

Данный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: культура представляет собой подвижные, грамотрицательные палочковидные клетки. Размер клеток в пределах (0,5-0,8)×(1,4-2,6) мкм.

Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На питательном агаре через 1 сутки роста при 20°С культура образует мелкие полупрозрачные колонии округлой формы.

На питательном бульоне при 20°С через 1 сутки наблюдается помутнение среды, заметно образование тонкого пристеночного кольца, слабая пленка на поверхности среды. В полужидком агаре наблюдается гомогенный рост культуры.

Физиолого-биохимические признаки: Факультативный анаэроб. Оксидазный тест положительный. Индол не образует. Катаболизирует глюкозу с образованием кислоты. Сбраживает мальтозу, D-маннозу. Уреазоотрицателен. Аргининдегидролаза отсутствует. Орнитин декарбоксилаза отсутствует. Ацетилметилкарбинол не образует. Сероводород не образует. Цитрат не утилизирует. Оптимум роста 20-25°С, рН 7,2-7,4. Оптимальная концентрация Nad 1,7-3%. Штамм не обладает токсичными и патогенными свойствами. Излучает свет, визуально регистрируемый в темноте.

Хранится штамм на питательном агаре с 1,7% NaCl, pH 7.2-7.4.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма:

- хранение бактерий в морозильной камере холодильника-рефрижератора при температуре -18°С в питательном бульоне с 1,7% Nad, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- хранение бактерий в низкотемпературном холодильнике при температуре -60°С в питательном бульоне с 1,7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- замораживание клеток в жидком азоте в питательном бульоне с 1.7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Размножение культуры осуществлятся путем пересева на питательный агаре 1,7% NaCl

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для биотестирования токсичности, так как характеризуется высокой чувствительностью биолюминесценции к действию широкого спектра токсикантов.

Пример 1.

Реализация использования штамма бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 в качестве тест-культуры для определения токсичности факторов среды химического происхождения была проведена на токсикантах ZnSO₄, CuSO₄, К₂Cr₂О₇, додецилсульфат натрия (ДСН) и фенол.

Штамм выращивали на питательном агаре с 1,7% NaCl при температуре 20°С в течение 18 часов. Затем готовили суспензию ночной культуры светящихся бактерий, оптическая плотность которой составляла 0,1 ед. при длине волны 590 нм. Далее полученную суспензию разбавляли в сто раз. Суспензия бактерий готовилась таким образом, чтобы конечная концентрация NaCl составила 1,7%; глюкозы - 0,01% в 0,001 М трис - HCl буфере (рН 7.4).

Аликвоты этой культуры (900 мкл) переносили в стерильные пробирки и добавляли в них изучаемые вещества в объеме 100 мкл. Содержимое пробирок тщательно перемешивали. Пробирки оставляли при комнатной температуре (20°С) на 30 минут. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивали. Измерение интенсивности биолюминесценции культур, содержащих анализируемые соединения, а также контрольных культур проводили на люминометре ЛТ-01. Результаты измерений интенсивности биолюминесценции представляли в условных единицах свечения (уес).

Оценку токсичности пробы проводили по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб. В качестве контроля использовали 1.7% раствор NaCl.

Для сравнительной оценки чувствительности использовали характеристику ЕС₅₀ (effective concentration) - концентрацию вещества, вызывающую 50%-ое снижение биолюминесценции бактериальной суспензии. Полученные данные по чувствительности штамма светящихся бактерий ко всем исследованным токсикантам представлены в таблице 1. В таблице также приводятся данные по чувствительности к этим же токсикантам lux-штамма E.coli.

Таблица 1ШтаммЕС 50, мг/лZnSO₄CuSO₄ДСНК₂Cr₂O₇ФенолVibrio fischeri ВКПМ В-95804-5220010-50125-150E.coli2-35-7,5300150>300

Сравнение чувствительности штаммов к исследованным токсическим веществам показало, что штамм Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 более чувствителен, чем lux-штамм E.coli (по средним значениям EC₅₀).

Величина ЕС₅₀ для ZnSO₄·7Н₂О для штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 лежит в диапазоне от 4 до 5 мг/л (концентрация цинка составляет от 0,904 до 1,13 мг/ л), а минимальная концентрация ЕС₅₀ для CuSO₄·5H₂O составляет 2 мг/ л (соответственно, концентрация меди составляет 0.512 мг/л).

Для бихромата калия величина ЕС₅₀ у штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 находится в диапазоне концентраций от 10 до 50 мг/л.

Для фенола величина EC₅₀ у штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 составила 125-150 мг.

Сравнение чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 к токсическим веществам с чувствительностью lux-штамма E.coli показало, что штамм Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 более чувствителен к CuSO₄ (примерно в 3 раза), ДСП (в 1,5 раза), К₂Cr₂О₇ (примерно в 5 раз), а также к фенолу (примерно в 2 раза).

Это свидетельствует о перспективности использования штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 для определения токсичности водных сред.

Пример 2.

Большой интерес представляет реакция светящихся бактерий на низкие концентрации загрязнителей, сопоставимые с уровнем ПДК и ниже, что позволяет использовать этот штамм, как тест-культуру при определении очень низких концентраций загрязнителей.

Были проведены измерения чувствительности биолюминесценции выделенных штаммов к действию токсических факторов химического происхождения в очень низкой концентрации. Использовались следующие токсиканты: ZnSO₄, CuSO₄, К₂Cr₂O₇, ДСП и фенол.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

В таблице 2 представлены данные по чувствительности выделенных штаммов светящихся бактерий ко всем исследованным токсикантам в диапазоне концентраций от 0,00001 мг/л до 1,0 мг/л.

Как видно из таблицы 2, медь в концентрации 0,001-0,005 мг/л (ПДК меди - 0,005 мг/л для морской воды) повышает люминесценцию штамма в пределах 12%. При концентрациях меди, начиная с 1 мг и выше, наблюдается заметное тушение биолюминесценции.

Цинк в концентрации 0.001-0.01 мг/л (ПДК цинка - 0.05 мг/л для морской воды) повышает интенсивность биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 в пределах 20-24%.

Интенсивность биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 под влиянием бихромата калия (ПДК 0,05 мг/л), в диапазоне концентраций 0,00001-1,0 мг/л, изменялась незначительно - максимально в пределах 20%.

Додецилсульфат натрия (ПДК 0,5 мг/л), в концентрации 0,00001-1,0 мг/л повысил интенсивность люминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 в среднем на 25% (максимум отмечен в концентрации 0.01 мг/л - на 40%).

Как следует из таблицы 2, фенол в концентрациях 0,00001-1,0 мг/л в целом оказывал сходное с фенолом и бихроматом калия влияние на интенсивность свечения штамма. При концентрация фенола на уровне 0.001-0.01 мг/л (ПДК фенола 0,001 мг/л) свечение штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 индуцировалось на 25%. В концентрации 1 мг/л свечение возрастало на 38%.

Таким образом, низкие концентрации токсикантов вызывают у бактерий стабильную индукцию биолюминесценции. Следует отметить, что заметная индукция свечения штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 (на 20-40%) наблюдалась на уровне ПДК токсикантов (7), либо значительно ниже ПДК (в 5-10 раз). Более высокие концентрации загрязнителей вызывали ингибирование биолюминесценции.

Полученные данные свидетельствует о высокой чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 и перспективности его использования для определения токсичности компонентов водной среды.

Пример 3.

Были проведены эксперименты по использованию штамма бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 в качестве тест-культуры на токсичность нефтепродуктов.

Для определения чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 к нефтепродуктам апробированы нефть, дизельное топливо и подсланевая (льяльная) вода из машинного отделения судна в концентрациях от 0,001 мг/л до 1,0 г/л.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

Полученные данные по чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 ко всем исследованным нефтепродуктам представлены в таблице 3. В таблице также приводятся данные по чувствительности биолюминесценции lux-штамма E.coli к тем же токсикантам.

Нефть в концентрации 0,01 мг/л, что значительно ниже ПДК нефти (0,05 мг/л) стимулировала свечение Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 на 53%.

Таблица 2Название токсикантаКон-
трольКонцентрация токсиканта, мг/л0,000010,00010,0010,0050,010,050,11 Интенсивность биолюминесценции Vibrio fischeri ВКПМВ-9580, уесМедь2,683,023,273,43,413,282,922,671,04Цинк2,7803,3503,4003,4303,4503,3303,1703,1501,364К₂Cr₂O₇3,203,273,423,543,83,533,523,422,82Додецилсулъфат натрия3,03,183,513,603,744,23,723,583,54Фенол2,633,183,263,273,263,283,313,513,63

Таблица 3 Концентрация нефтепродукта, мг/лНазвание нефтепродуктаКон-
троль0,0010,010,11,0101002505001000Интенсивность биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМВ-9580, уесНефть0,530,670,810,620,590,490,470,450,420,40Диз. топливо0,530,730,820,720,660,630,510,460,430,40Льяльная вода0,550,710,720,640,610,580,520,470,440,41Интенсивность биолюминесценции штамма E.coli.yecНефть0,0570,0480,0530,0390,0310,0260,014   Диз. топливо0,0580,0530,0600,0430,0400,0390,029   Льяльная вода0,0610,0500,0480,0420,0380,0370,035   

Льяльные воды, дизельное топливо также увеличивали свечение этого штамма в концентрации 0,01 мг/л (на 30-55%, соответственно). Индукция свечения наблюдалась в диапазоне испытанных концентраций нефтепродуктов от 0,001 до 0,1 мг/л.

Сравнение чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 и lux-штамма E.coli свидетельствует о более высокой чувствительности штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 и перспективности его использования для определения токсичности компонентов среды водоемов.

Пример 4.

Для определения токсичности природных проб с помощью штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 были взяты образцы донных отложений морских водоемов. Один образец с высоким содержанием нефтепродуктов и тяжелых металлов был отобран в районе с высокой антропогенной нагрузкой на акватории одного из портов Азовского моря. Другой грунт для биотестирования с аналогичным гранулометрическим составом был отобран в условно чистом морском лимане, изолированном от моря естественной галечной косой (в 5 км от м. Б.Утриш).

Для проведения тестирования экстракты грунтов готовились на воде.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

В таблице 4 представлены результаты биотестирования токсичности усредненных проб грунтов, отобранных в морском лимане и на акватории порта.

Таблица 4Район отбора донных отложенийИнтенсивность биолюминесценции Vibrio fischeri ВКПМ В-9580, уесКонтрольОпытОтклонение от контроля,%Лиман0.6450.640-0.78Морской порт0.4130.65057.4

Как видно из данных, представленных в таблице 4, интенсивность свечения водного экстракта донных отложений из лимана практически не отличалась от контроля, а интенсивность биолюминесценции пробы с экстрактом грунта из акватории морского порта превышала контрольный уровень на 57,4%. Полученные данные свидетельствуют о чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 к действию токсикантов, присутствующих в донных отложениях морских водоемов.

Таким образом, тестирование токсичности одного из основных компонентов среды - донных отложений, продемонстрировало возможность использования предложенного штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 в качестве тест-культуры.

Литература

1. И.Ю.Малыгина, А.М.Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып.64.

2. КНД 211.1.4.060-97. Визначення токсичностi води на бактерiях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford. - 21.05.97.

3. ТУ 6-09-20-236-93 (прототип).

4. МР №11-1/134-09. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий.

5. МР №11-1/131-09. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста

6. МР №11-1/133-09. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм».

7. Перечень рыбохозяйственных нормативов: предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды, водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение - М.:ВНИРО, 1999. - 304 С.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при проведении эколого-токсических исследований, при мониторинге водных экосистем. Штамм Vibrio fischeri ВКПМ В-9580, обладающий высокой чувствительностью к действию токсических веществ самой разнообразной химической природы, может быть использован при тестировании токсичности донных отложений. Изобретение позволяет повысить чувствительность тест- культуры к действию токсических веществ самой разной химической природы. 4 табл.

Штамм бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9580, используемый в качестве тест-культуры для определения токсичности объектов окружающей среды.