Способ определения активности грамицидина @ Советский патент 1986 года по МПК G01N33/15 C12Q1/02 C12Q1/06 

Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано для определения активности грамицидина С,

Цель изобретения - сокращение вре- мени анализа и его упрощение.

Цель достигается за счет использования в качестве тест-объекта суспензии Photobacterium teiognathi, что позволяет оценить активность ан- тибиотика по степени падения люминесценции.

Культуту Photobacterium eiognathi выращивают на полусинтетической среде до достижения максимальной интенсивности свечения. Готовят бактери- ал.ьную. суспензию путем центрифугиро- .вания ресуспендирования в фосфатно

солевом буфере до концентрации .около 10 кл/мл. Полученную суспензию хранят, при +4 С до использования (не более 2-х суток).

Для проведения анализов используют бактериальную суспензию, содержащую от I lO до 2-10 кл/мл.

Концентрацию грамицидина определяют следующим образом.

Стандартный и испытуемый препараты грамицидина в разных разведениях помещают.в кюветы люминометра туда же добавляют по 1 мл бактериальной суспензии. В течение 20 мин регистрируют свечение на ленте самописца от всех кювет. Затем определяют степень падения люминесценции в опытной пробе по сравнению со стандартом.

Пример 1. Для получения исходного препарата индикаторных бактерий штамм Photobacterium eiognath засевают в 10П мл полусинтетической среды. Колбу с культурой инкубируют при на качалке, регистрируя рост и развитие люминесценции описаннъгли методами. После достижения максимальной интенсивности свечения клетки отделяют от среды центрифугированием (5000 g, 10 мин) и суспендируют в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,1, содержащего 0,5 М NaCl. Полученная таким образом суспензия содержит около 1П кл/мл и может храниться без значительной потери люминесцентной активности в течение

2 сут при +4 С.

Количественное определение грамицидина основано на сравнении степени угнетения свечения разными центрациями стандартного и определяемого препаратов.

Исходную суспензию бактерий разводят в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 510 кл/мл.

В кюветы наливают по 1 мл бактериальной суспензии и такое количество стандартного раствора антибиотика, чтобы его концентрация в кюветах составляла 20 ед/мл, 25 ед/мл,

30 ед/мл. В качестве опытного образца в кюветы с суспензией вносят известное количество того же стандартного раствора грамицидина. Все пробы стандартные в двух, а опытные в трех

повторностях помещают в установку, в которой регистрируют люминесценцию ( 3 ) в течение 20 мин на ленте самописца.

При обработке результатов з качестве количественной меры степени угнетения свечения используют параметры, равные отношению свечения после 15 мин контакта бактерий с антибиотиками к его исходному уровню (,,

Значения этого параметра усредняют по повторностям и заносят в таблицу.

Таблица 1

По полученньм значениям для каждого из экспериментов строят калибровочный график и по нему определяют расчетную концентрацию антибиотика в пробе. 20

Расхождение между расчетными и истинными концентрациями антибиотика в пробах не превьппает 10%.

Пример 2. Исходную суспензию бактерий разводят до концентра- 25

Концентрация антибиотика в пробе, при соотношении g Д/

ОI 23 I26 I29 Г 32

1,1 0,780,630,54 0,48

1.00,580,510,37 0,27

1.10,360,310,26 0,20

В указанном диапазоне концентраций бактерий зависимость степени угнетения люминесценции от концентрации антибиотика носит практически линейный характер, что позволяет проводить необходимые

измерения.

V

Время анализа составляет 1 ч по сравнению с 20 ч по известному способу, также сокращается число опера- ций за счет устранения ряда операций по культивированию бактерий на чашках Петри.

ВНШИШ Заказ 4845/43 Тираж 778 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

12559204

Продолжение табл.1

Расчетная концентра- . ция антибиотика, ёд/нл

ций 2-10, 5-10 1 10 кл/мл. Каждое из разведений разливают в кюветы по 1 мл, к которым добавляют 23, 26, 29 и 32 ед/мл грамицидина. Регистрируют свечение всех кювет в течение 20 мин и определяют степень угнетения свечения за 15 мин.контакта с антибиотиком. Результаты измерений сведены в табл. 2. Таблица 2

40 Формула изобретения

Способ определения активности грамицидина С путем контактирования тест-объекта с антибиотиком с последующей оценкой его действия на тест- объект, отличающийся тем.

что, с целью сокращения времени анализа и его упрощения, в качестве тест-объекта к антибиотику добавляют суспензию Photobacteriim leiognathi с концентрацией клеток 10 - 2-10 в 1 мл, а активность антибиотика определяют по степени падения люминесценции.

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - сокращение времени анализа. Готовят бактериальную суспензию. Стандартный и испытуемый препараты грамицидина С в разных разведениях .помещают в кюветы люми- нометра и добавляют туда по 1 мл бактериальной суспензии. В течение ; 20 мин регистрируют свечение. В опытной пробе определяют степень падения люминесценции по сравнению со стандартом. 2 табл.