СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 G01N21/76 C12Q1/02 C12Q1/04 

Изобретение относится к области биотехнологии, фармации, экологии и медицины, и может быть использовано для определения антимикробной активности антибиотиков, фармацевтических субстанций не антибиотиков и вновь синтезируемых соединений, а также для скрининга синтезируемых веществ и мониторинга загрязнения окружающей среды веществами с выраженными антимикробными свойствами.

В настоящее время обеспечение безопасности лекарственного препарата в сфере обращения осуществляется в соответствии требований GMP, согласно которым антибиотики, используемые в медицинской практике, могут быть разрешены к практическому применению, после прохождения всесторонних испытаний. Поиск и разработка новых методов контроля качества лекарственных средств, в том числе антибиотиков, является одной из фундаментальных задач фармацевтической науки. Одними из параметров, характеризующими качество антибиотиков являются содержание лекарственных веществ, концентрация, масса, антимикробная активность.

Известен способ оценки антимикробной активности антибиотиков (Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Т. 1., Москва; 2018.), заключающийся в применении метода диффузии в агар с использованием трехдозного варианта или стандартной кривой, основанном на сравнении размеров зон угнетения роста тест-штамма микроорганизмов, которые образуются при внесении в лунки испытуемых растворов противомикробного агента.

Однако, к недостаткам данного способа можно отнести такие, как недостаточная точность оценки, в связи с тем, что используются в качестве измерительных приборов линейки, штангенциркули, микрометры и другие приборы, что влияет на получение высокоточных результатов, а также способ характеризуется трудоемкостью процесса подготовки и поддержания чашек с агаром.

Известен способ определения антиоксидантной активности вещества (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под редакцией Хабриева Р.У., М., 2005), состоящий из выделения макрофагов из животных, активации макрофагов, добавления люминола и исследуемого антиоксиданта, ингибирующего окисление люминола.

Однако данный способ является трудоемким и дорогостоящим, а также не позволяет тестировать жирорастворимые антиоксиданты, не является универсальным.

Известен способ определения антиоксидантной активности вещества (Патент РФ №2376380), заключающийся в приготовлении рабочей и контрольной биолюминесцентных проб, причем для приготовления контрольной пробы используют буферный раствор, а для приготовления рабочей пробы - буферный раствор с добавлением растворителя с исследуемым веществом, с последущим добавлением оксиданта в рабочую и контрольную пробы, регистрации интенсивности биолюминесценции и по ее интенсивности судят об антиоксидантной активности вещества.

Однако данный способ предназначен для определения антиоксидантной активности только гуминовых веществ, что не позволяет определять антиоксидантную активность всех веществ как водорастворимых, так и жирорастворимых веществ, также для осуществления данного способа требуются достаточно редкие, а значит дефицитные и дорогие вещества.

Известен способ определения антиоксидантной активности вещества (Патент РФ 2571229), включающий приготовление контрольных проб, содержащих буферный раствор и биолюминесцентный сенсор, определение исходной интенсивности биолюминесценции, причем добавляют в часть контрольных проб исследуемое вещество с получением рабочих проб, уравнивают объемы контрольных и рабочих проб, определяют интенсивность биолюминесценции контрольных и рабочих проб после их инкубации для определения токсичности исследуемого вещества; добавляют в контрольные и рабочие пробы оксидант и определяют интенсивность биолюминесценции контрольных и рабочих проб с оксидантом после их инкубации для определения антиоксидантной активности исследуемого вещества.

К недостаткам способа относятся такие, как невысокая точность, длительность и сложность осуществления.

В качестве прототипа выбран способ биотестирования веществ различной природы (Bulich A., Tung K., Scheibner G. Lluminescent bacteria toxicity test: его потенциально является in vitro alternative. J. Biolumin. Chemilumin, 1990; 5:71-77), который заключается в измерении интенсивности биолюминесценции фотобактерий с помощью биолюминометра, при этом лиофильно-высушенные или свежевыращенные светящиеся бактерии видов Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognath, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi разводят в буферном растворе с pH=7 после чего в кюветах люминометра смешивают с разными концентрациями или растворениями анализируемого раствора, после инкубации при температуре 20-25°C измеряют интенсивность биолюминесценции по сравнению с контролем - суспензии. светящихся бактерий без добавления анализируемого раствора, а результаты представляют в виде эффективной концентрации веществ (ЭК), ингибирующих биолюминесценцию на 50% - ЭК₅₀, которая является критерием их токсичности, аналогично величине ЛД₅₀, используемых в тестах на животных.

Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого способа, являются: подготовка бактериальной суспензии, смешивание ее с анализируемым образцом, инкубация, измерение интенсивности свечения фотобактерий и определение эффективной концентрации вещества (ЭК), ингибирующего биолюминесценцию по сравнению с биолюминесценцией контрольного образца.

Недостатками данного способа являются невысокая точность, трудоемкость процесса, поскольку анализ каждого отдельного образца проводят поочередно и, как следствие, низкая скорость проведения анализа.

Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов оценки антимикробной активности веществ с существенными признаками заявляемого способа.

Вышеописанный уровень техники свидетельствует о том, что при оценки антимикробной активности веществ проблемой является не высокая точность, длительность и трудоемкость.

Техническим результатом, достигаемым изобретением, является повышение точности и скорости оценки, уменьшение трудоемкости.

Разработка способа оценки антимикробной активности веществ путем замены модельных токсикантов на стандартные рабочие образцы антибиотиков, позволяющие выявить зависимости между снижением интенсивности люминесценции и антимикробным действием антибактериальных веществ, получив при этом данные позволяющие проводить контроль качества антибиотиков и лекарственных препаратов на их основе с применением эффективной концентрации веществ, ингибирующих биолюминесценцию на 80%, что позволяет решить вышеуказанную проблему.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки антимикробной активности веществ, включающем подготовку бактериальной суспензии, смешивание ее с анализируемым образцом, инкубацию, измерение интенсивности свечения фотобактерий и определение показателя эффективной концентрации вещества (ЭК), ингибирующего биолюминесценцию по сравнению с биолюминесценцией контрольного образца, согласно изобретению, бактериальную суспензию готовят путем разбавления ночной культуры тест-штамма P. leiognathi Sh1 3% натрия хлоридом 1:50, действие оценивают по ингибированию биолюминесценции светящихся бактерий в зависимости от концентраций антибиотиков и вычисления индекса биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 по следующей формуле: БЛИ = I_i/I₀ × 100%, где I_i - интенсивность люминесценции бактерий в опытной пробе, I₀ - интенсивность свечения бактерий в контроле, причем при регистрации люминесценции используют рабочие стандартные образцы антибиотиков, позволяющие в дальнейшем использовать полученные математические модели в виде стандартных кривых для сравнения антимикробного действия антибиотиков при контроле их качества, а также проводить сравнение исследуемых веществ с эталонными образцами по рассчитанным ЭК, при их соответствии; причем одним из параметров, который оценивают является ЭК₈₀, характеризующая наличие антимикробного действия веществ.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в следующем: использование бактериальной суспензии культуры тест-штамма P. Leiognathi, проведение оценки действия по ингибированию биолюминесценции светящихся бактерий в зависимости от концентраций антибиотиков и вычисления индекса биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 позволит создать конкурентоспособные отечественные аналоги зарубежных биохемилюминесцентных тест-систем, а также значительно сократить время осуществления анализа пробы, что составляет от 15 до 120 минут по сравнению с известным методом диффузии в агар, что составляет 1 сутки, Microtox®Rapid Toxicity Detection, в котором определяют снижение интенсивности свечения на 50% под действием токсиканта примерно за 30-60 минут. Причем измерение параметров, характеризующих антимикробную активность в методе диффузии в агар занимает около 1-2 минуты, а для заявляемого способа - 10 секунд.

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения антимикробной активности используют антибиотики: производные 6-аминопенициллановой кислоты - ампициллин (ОАО «Синтез», Россия, серия 1540815), бензилпенициллин натрия (ОАО «Синтез», Россия, серия 230310) и пенициллин G (SANDOZ, GmbH, Австрия, серия 147305); производные нафтацена - доксициклина (ОАО «Синтез», Россия, серия 03211) и тетрациклина (ВАТ «Вітаміни», Украина, серия 10409) гидрохлориды; аминогликозиды (АГ) - гентамицина (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, серия 20509) и стрептомицина (ВАТ «Київмедпрепарат», Украина, серия 170410) сульфаты; производные 7-аминоцефалоспорановой кислоты - цефотаксим (ЗАТ НВЦ «Борщаговский химико фармацевтический завод», Украина, серия 120907), цефепим (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, серия 10110) и цефтриаксон (ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, серия CN10110).

В качестве культуры микробных клеток используют P. leiognathi Sh1, из коллекции Института биохимических технологий, экологии и фармации ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского»

Для исследования токсичности выполняют следующие этапы.

Готовят бактериальную суспензию, приготовленную путем разбавления ночной культуры тест-штамма 3% натрия хлоридом 1:50. Данное соотношение разведения характерно для тест-штамма P. leiognathi Sh1, так как позволяет получить достоверный сигнал интенсивности свечения и содержит оптимальное количество клеток микроорганизмов -10³ кл/мл, при котором может быть зафиксирована величина отношения аналитического сигнала к уровню шума.

В кюветах люминометра готовят свежеприготовленные растворы антибиотиков из лиофилизированных субстанций.

К испытуемым растворам антибиотиков вносят 50 мкл бактериальной суспензии.

Измеряют интенсивность свечения люминесцентных бактерий, например, с использованием устройств, фиксирующих бактериальную биолюминесценцию тест-штаммов - биохемилюминометра БХЛ-06 (НПО «Биофармавтоматика», Н. Новгород, Россия) и LumiShot (Красноярск, Россия).

Сравнивают ингибирование биолюминесценции светящихся бактерий от концентраций антибиотиков через 15 минут, 30 минут и 18 часов.

Действие оценивают по ингибированию биолюминесценции светящихся бактерий в зависимости от концентраций антибиотиков и вычисления индекса биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 по следующей формуле: БЛИ = I_i/I₀×100%, где I_i - интенсивность люминесценции бактерий в опытной пробе, I₀ - интенсивность свечения бактерий в контроле.

При регистрации люминесценции используют рабочие стандартные образцы антибиотиков, позволяющие в дальнейшем использовать полученные математические модели в виде стандартных кривых для сравнения антимикробного действия антибиотиков при контроле их качества, а также проводить сравнение исследуемых веществ с эталонными образцами по рассчитанным ЭК, при их соответствии.

Одним из параметров, который оценивают является ЭК₈₀, которая в большей степени характеризует наличие антимикробного действия веществ, чем ЭК_50, предлагаемая в прототипе.

Статистический анализ проводят согласно требований ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента» и ОФС.1.1.0014.15 «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами» с помощью программы Microsoft Excel.

Пример 1.

Определение антимикробной активности антибиотиков приведено в таблице.

Наименование антибиотика, производитель, серия Концентрация, мкг/мл 0 1 2 4 5 10 Ампициллин
(ОАО «Синтез», Россия, 1540815) 100±3,2 92,5±2,9 87,8±2,8 66,2±2,1 57,4±1,8 51,0±1,6 Бензилпенициллин
(ОАО «Синтез», Россия, 230310) 100±3,2 74,9±2,4 65,8±2,1 57,6±1,8 52,7±1,7 38,5±1,3 Пенициллин G
(SANDOZ, GmbH, Австрия, 147305) 100±10 51,6±4,1 47,4±4,7 30,4±3,0 28,4±2,6 12,1±1,2 Тетрациклин
(ВАТ «Вітаміни», Украина, 10409) 100±0,6 5,1±0,03 1,7±0,01 0 0 0 Доксициклин
(ОАО «Синтез», Россия, 03211) 100±5,3 29,7±2,4 18,7±1,07 6,2±0,3 2,3±0,1 0 Стрептомицин
(ВАТ «Київмедпрепарат», Украина, 170410) 100±3,5 46,6±1,6 22,4±0,8 8,9±0,3 5,7±0,2 2,8±0,1 Гентамицин
(ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, 20509) 100±4,6 72,9±4,4 64,3±4,3 58,7±3,7 40,6±3,9 1,5±2,5 Цефепим
(ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, 10110) 100±6,2 57,2±3,6 33,3±2,03 18,1±1,1 9,6±0,6 4,6±0,3 Цефтриаксон
(ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина, CN10110) 100±3,2 39,6±1,3 23,7±0,8 6,9±0,2 5,9±0,2 3,1±0,1 Цефотаксим
(ЗАТ НВЦ «Борщаговский химико-фармацевтический завод», Украина, 120907) 100±9,2 42,8±3,9 27,6±2,5 10,6±0,9 3,6±0,4 4,1±0,4

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки антимикробной активности веществ, включающий подготовку бактериальной суспензии путем разбавления ночной культуры тест-штамма Photobacterium leiognathi Sh1 3% натрия хлоридом до содержания в ней клеток микроорганизмов - 10³ кл/мл, затем сначала оценивают антимикробную активность рабочих стандартных образцов антибиотиков по ингибированию биолюминесценции светящихся бактерий в зависимости от концентраций антибиотиков и вычисляют индекс биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 по следующей формуле: БЛИ = I_i/I₀ × 100%, где I_i – интенсивность люминесценции бактерий в опытной пробе, I₀ – интенсивность свечения бактерий в контроле. При регистрации люминесценции используют рабочие стандартные образцы антибиотиков, получают стандартные кривые, рассчитывают для эталонных образцов ЭК₈₀; оценивают ингибирование биолюминесценции светящихся бактерий образцами исследуемых веществ, вычисляют индекс биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 - БЛИ и ЭК₈₀, сравнивают с эталонными образцами и оценивают антимикробную активность веществ. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов определения антимикробной активности антибиотиков, фармацевтических субстанций. 1 табл., 1 пр.

Способ оценки антимикробной активности веществ, включающий подготовку бактериальной суспензии, смешивание ее с анализируемым образцом, инкубацию, измерение интенсивности свечения фотобактерий и определение показателя эффективной концентрации вещества (ЭК), ингибирующего биолюминесценцию по сравнению с биолюминесценцией контрольного образца, отличающийся тем, что бактериальную суспензию готовят путем разбавления ночной культуры тест-штамма Photobacterium leiognathi Sh1 3% натрия хлоридом до содержания в ней количества клеток микроорганизмов -10³ кл/мл, затем сначала оценивают антимикробную активность рабочих стандартных образцов антибиотиков по ингибированию биолюминесценции светящихся бактерий в зависимости от концентраций антибиотиков и вычисляют индекс биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 по следующей формуле: БЛИ = I_i/I₀ × 100%, где I_i – интенсивность люминесценции бактерий в опытной пробе, I₀ – интенсивность свечения бактерий в контроле, причем при регистрации люминесценции используют рабочие стандартные образцы антибиотиков, получают стандартные кривые, рассчитывают для эталонных образцов ЭК₈₀; и оценивают ингибирование биолюминесценции светящихся бактерий образцами исследуемых веществ, вычисляют индекс биолюминесценции Photobacterium leiognathi Sh1 - БЛИ и ЭК₈₀, сравнивают с эталонными образцами и оценивают антимикробную активность веществ.