ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К CHLAMYDIA Российский патент 2000 года по МПК C12N5/12 

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к штамму гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для создания диагностических препаратов для идентификации C. psittaci. Известны штаммы гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела (М-АТ) Хла-62, Хла-154, Хла-159, Хла-175, Хла-178, Хла-366 и другие к антигенам Ch.psittaci (1). Полученные штаммы гибридом являются менее активными и специфическими и менее пригодны для создания диагностических препаратов для экспресс-диагностики Ch.psittaci.

Целью изобретения является получение высокоактивного штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам C.psittaci для последующего конструирования на их основе высокоспецифичных и стандартных отечественных тест-систем для экспресс-диагностики хламидийных инфекций методом прямой иммунофлуоресценции у животных и птиц.

Штамм получают следующим образом. Для получения гибридомы используют штамм C.psittaci "К-1" возбудителя хламидиозного конъюнктивита кошек. Самок мышей линии BALB/c, массой 10-12 г иммунизируют антигеном с полным адъювантом Фрейнда внутрибрюшинно, двукратно, с интервалом в 14 дней взвесью элементарных телец хламидий, инактивированных формалином и разрушенных Тритоном Х-100. Бустерную иммунизацию проводят через 1 мес, за 3 дня до слияния, используя ту же дозу антигена в физиологическом растворе. Антиген вводят в интраорбитальный венозный синус (100 мкг) и внутрибрюшинно (200 мкг). Слияние клеток мышиной миеломы линии NSO с клетками периферических лимфатических узлов (паховых и подколенных) мышей линии BALB/c, взятых в соотношении 1:3 проводят через 3 дня после последней инъекции по стандартной методике с использованием 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с м.м. 1000 и распределяют в селективной среде HAT на 96-луночных планшетах (фирмы "Flow") со слоем-кормилкой из тимоцитов. Планшеты с клетками культивируют в атмосфере с 5% CO₂. Температура культивирования - 36,5^oC. Каждые три дня селективную среду в планшетах заменяют на свежую. Начиная с 20-х суток с момента слияния гибридные клетки пересевают в 24-луночные планшеты со слоем-кормилкой из тимоцитов. Клоны выращивают до формирования сплошного слоя, и в культуральной жидкости определяют наличие специфических антител.

Скрининг антителопродуцирующих клонов проводят методом прямого твердофазного ИФА с использованием антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов, где в качестве твердой фазы используют элементарные тельца хламидий, инактивированных формалином (15-20 мкг на лунку), а в качестве неспецифического антигена используют антиген, приготовленный из неинфицированных желточных оболочек КЭ, приготовленных как и специфический антиген. Антителопродуцирующие клоны выращивают в пластиковых флаконах площадью 25 см² со слоем-кормилкой из тимоцитов, с последующей оценкой активности и специфичности М-АТ в культуральных жидкостях и отбором моноклонов с наибольшим накоплением в массовой культуре.

Отбирают гибридому, представляющую моноклон с групповой специфичностью к антигенам Chlamydia psittaci - Хла "К-1". Моноклональные антитела, продуцируемые Хла "К-1", способны реагировать со всеми исследованными штаммами Ch. psittaci и Ch. trachomatis в двух серологических реакциях ИФА и НРИФ. М-АТ Хла "К-1" в РСК не активируют комплемент.

Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов под номером Хла-К-1 ДЕП.

Полученный штамм Хла-К-1-ДЕП имеет следующие характеристики.

Морфология гибридомы Хла-К-1.

Клетки гибридной линии округлой формы, отличаются от родительской линии несколько большими размерами.

Культуральные свойства.

Гибридому Хла-К-1 выращивают в питательной среде RPMI-1640 с 0,1% NaHCO₃, глюкоза 4 г/л, 10% сыворотки эмбрионов коров; пирувата натрия - 0,05 мг/см³, инсулина - 0,2 ед/см³, HEPES - 10 мМ. Температура культивирования - 36,5^oC. Клетки гибридомы растут в суспензии, обладают слабой адгезивной способностью к поверхности пластика или стекла. Посевная доза - 250-300•10³ клеток/см³, кратность рассева 1:3-1:4 два раза в неделю.

Гибридома Хла-К-1 в 100% случаев злокачественна и в организме сингенных мышей линии BALB/c в возрасте старше 2-2,5 месяцев, сенсибилизованных внутрибрюшинным введением 0,5 см³ пристана, формирует асцитную опухоль. Асцитные опухоли формируются у мышей на 8-14 день после введения 2-5•10⁶ гибридных клеток.

Титры в иммунных асцитических жидкостях (в обратных величинах) составляют в ИФА от 2•10⁶ до 1•10⁷, в РНИФ 1:640-1:1280.

Стабильность гибридомы Хла-К-1.

Стабильность продуцирования антител гибридными клетками сохраняется на протяжении 70 пассажей в культуре клеток и 5 пассажей на мышах линии BALB/c (время наблюдения).

Условия хранения и поддержания жизнеспособности гибридомы Хла-К-1.

Гибридому Хла-К-1 хранят криоконсервированной в жидком азоте. Среда для замораживания - 90% эмбриональной сыворотки рогатого скота, 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: до минус 70-80^oC, далее жидкий азот (-196^oC). Восстановление после размораживания: быстрое размораживание при 37 - 39^oC, разводят в 10 раз сывороткой эмбрионов коров, осаждают центрифугированием при 500 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде в концентрации 3-4•10⁵ клеток/см³. Жизнеспособность восстановленных клеток составляет 70-80% и устанавливается по дифференциальной окраске клеток с использованием 0,25% раствора трипанового синего, pH=7,2-7,3.

Популяция гибридных клеток Хла-К-1 свободна от плесневых грибов, дрожжей, бактериальных и микоплазменных контаминантов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Определяют активность и специфичность моноклональных антител (М-АТ), полученных из асцитической жидкости мышей линии BALB/c, иммунизированных культурой гибридомы Хла-К-1.

Активность и специфичность М-АТ определяют в ИФА и НРИФ. Для ИФА используют пероксидазные конъюгаты М-АТ, которые готовят периодатным методом по M.Wilson и P.Nakane.

Для постановки ИФА применяют корпускулярный антиген из элементарных телец (ЭТ) C.psittaci, штамм "К-1", "Лори", "Ростиново-70", C.trachomatis серовар L2 и штамм "CM", очищенных и концентрированных путем дифференциального центрифугирования и в ступенчатом градиенте сахарозы и инактивированных формалином. Результаты ИФА учитывают на многоканальном спектрофотометре "Titertek Multiskan" фирмы "Flow" при длине волны 492 нм.

Непрямую реакцию микроиммунофлюоресценции (НРИФ) проводят на обезжиренной поверхности лунок предметного стекла (фирма "Flow"). В качестве антигенов используют суспензию оболочек желточных мешков, инфицированных указанными ранее штаммами. Фиксацию антигенных слайдов проводят холодным ацетоном (4^oC) в течение 20 мин. Готовые слайды хранят при минус 20^oC.

На каждую группу антигенов наносят по 0,6 см³ разведений исследуемых материалов (культуральных и асцитических жидкостей), приготовленных на фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) pH 7,4. Инкубацию проводят во влажной камере при 37^oC в течение 30 мин. Затем слайды ополаскивают ФСБ и промывают 2 раза по 5 мин в отмывочной камере. Слайды слегка подсушивают и наносят люминесцентную сыворотку кролика против иммуноглобулинов белой мыши (производства НИИЭМ им. Гамалеи) в рабочем разведении.

Для окраски фона в люминесцентную сыворотку добавляют синьку Эванса в конечном разведении 1: 10000. Слайды инкубируют 30 мин при 37^oC во влажной камере, отмывают 3 раза в ФСБ pH 7,4 по 5 мин, а затем подсушивают на воздухе с нанесением 1-2 капель забуференного глицерина pH 8,5 и накрывают покровным стеклом.

Окрашенные препараты исследуют в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ И-3 при комбинации светофильтров СЗС 24-4, ФС 1-4, БС 8-3 и увеличении 600-1000Х на наличие в исследуемых пробах специфического свечения и морфологических особенностей хламидий.

Результаты по определению специфичности и активности моноклональных антител гибридомы Хла-К-1 в ИФА и НРИФ приведены в таблице.

Данные таблицы иллюстрируют высокую активность и специфичность М-АТ, содержащихся в асцитической жидкости, продуцируемых гибридомой Хла-К-1 как в отношении C.psittaci, так и C.trachomatis.

Пример 2.

Моноклональные антитела, полученные из асцитической жидкости двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения, используют в качестве фиксирующих антител в "сэндвич"-ИФА. Для иммобилизации на микропанелях моноклональные антитела берут в концентрации 50 мг/см³, а в качестве детектирующих антител используют поликлональную антисыворотку. Для детекции используют очищенные ЭТ хламидий, культуральную жидкость, содержащую липополисахарид (ЯПС), сыворотку крови от экспериментально зараженных и спонтанно инфицированных животных. Чувствительность метода при этом составляет 25 нг/см³.

Пример 3.

20 см³ полученной асцитической жидкости (АЖ) оттаивают в водяной бане при температуре 18-25^oC и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 минут. После центрифугирования и отделения липидов к АЖ добавляют ацетатный буферный раствор и по каплям каприловую кислоту до конечной концентрации 1,1%. Смесь подвергают перемешиванию на магнитной мешалке в течение 30 минут с последующим ее центрифугированием при 1000 об/мин в течение 30 минут при 5^oC. Отделяют сгусток каприловой кислоты, а жидкость, содержащую М-АТ, фильтруют, диализуют против фосфатно-буферного раствора, а затем М-АТ из асцитической жидкости преципитируют насыщенным раствором сульфата аммония. Выпавший преципитат осаждают центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок растворяют фосфатно-буферным раствором pH=7,2 и ставят на диализ против того же буферного раствора. Выход очищенных М-АТ - 3 см³. Концентрация белка - 15 мг/см³.

Устанавливают в ИФА активность очищенных М-АТ, которая не должна быть ниже разведения 1:50000.

Буферные растворы хламидийных М-АТ очищают, пропуская через хроматографические колонки с гелем сефадекса. Фракции М-АТ собирают под контролем содержания белка, используя 10% сульфосалициловую кислоту. Концентрацию белка измеряют по Лоури, которая составляет более 10 мг/см³.

В очищенный белковый пул М-АТ добавляют приготовленный непосредственно перед смешением изотиоцианат-флуоресцеина (ФИТЦ) из расчета 0,3 см³ раствора флуорохрома (концентрация 1 мг ФИТЦ в 1 см³ буферного раствора) на 1 см³ раствора М-АТ. Смесь компонентов выдерживают при температуре 18-25^oC в течение 2 часов. Окрашенный раствор М-АТ очищают от несвязавшегося ФИТЦ, пропуская через хроматографические колонки с гелем сефадекса. Очищенный конъюгат имеет желтовато-оранжевый цвет.

Устанавливают степень конъюгирования окрашенных ФИТЦ М-АТ по отношению флуорохром/белок по оптической плотности реагента при 280 нм и 495 нм. Соотношение флуорохром/белок должно быть не менее 1,0.

В приготовленный конъюгат вносят сывороточный альбумин в качестве стабилизатора, азид натрия для консервации и равное по объему количество раствора синьки Эванса. Готовый препарат флуоресцирующих М-АТ представляет собой прозрачную жидкость синего цвета. При условии хранения при температуре 4^oC жидкий диагностикум сохраняет свои биологические свойства в течение 2 месяцев. Устанавливают активность флуоресцирующих М-АТ по их красящему титру. Красящий титр определяют путем окрашивания препаратов из инфицированных и фиксированных клеток приготовленным препаратом (0,3 см³) разведенного от 1:8 до 1:256. Флуоресцирующие М-АТ должны иметь красящий титр не ниже 1:32 при отсутствии специфического свечения в контрольных препаратах, приготовленных из неинфицированных клеточных культур.

Контроль специфичности флуоресцирующих М-АТ осуществляют на препаратах из инфицированных и неинфицированных клеточных культур с нанесением на один антихламидийных М-АТ, на другой - контрольной неиммунной асцитической жидкости. В препаратах из инфицированных клеточных культур, окрашенных после предварительной обработки контрольной неиммунной АЖ, выявляют специфическое внутри- и внеклеточное свечение, а в препаратах, предварительно обработанных хламидийными М-АТ, - свечение отсутствует.

Флуоресцирующие иммуноглобулины, отвечающие требованиям по активности, специфичности и стерильности, фасуют в ампулы типа ШП-3 или во флаконы ФИ-5 по 0,1±0,02 см³ и лиофильно высушивают. Ампулы запаивают, флаконы укупоривают резиновыми пробками и обжимают алюминиевыми колпачками.

Лиофильно высушенный диагностикум представляет собой в ампуле или флаконе сухую гомогенную аморфную массу синевато-сиреневого цвета. При хранении в сухом, темном месте при температуре 2-8^oC препарат сохраняет свои биологические свойства в течение 18 месяцев.

Пример 4.

Приготовленные по примеру 3 лиофилизированные М-АТ смешивают с растворителем. Растворенный реагент хранят в темноте при температуре 2-8^oC в течение 6 недель. Готовят мазки отпечатки после взятия материала со слизистых оболочек респираторного или урогенитального тракта от 12 больных животных на предметные стекла с лунками. Высушенные мазки фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин, либо наносят на мазки по 0,1 см³ ацетона до его полного испарения. На зафиксированные мазки с помощью микропипетки наносят по 0,3 см³ меченых антител и помещают во влажную камеру на 30 мин при 37^oC с последующей промывкой препаратов дистиллированной водой и их просушкой. На подсушенные препараты наносят по 0,3 см³ жидкости для заключения под покровные стекла с последующим их микроскопированием в люминесцентном микроскопе.

В 10 исследуемых препаратах зарегистрировано ярко-зеленое или желтовато-зеленое свечение в виде цитоплазматических включений, а также в виде образований правильной круглой формы с ровными краями размером около 300 мкм (1/100 размера интактной клетки), расположенных внеклеточно. Эпителиальные клетки в препаратах окрашены в ярко-красный цвет. Диагноз установлен на хламидиоз как положительный. Однако в двух препаратах специфического свечения не установлено. Результат исследования на хламидиоз отрицательный.

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши продуцирует моноклональные антитела, позволяющие идентифицировать штаммы хламидий, возбудителей орнитоза (пситтакоза), пневмоний, абортов, полиартритов, энцефалитов, кератоконъюнктивитов домашних и сельскохозяйственных животных и птиц. Приготовленный препарат моноклональных антител в реакции прямой иммунофлуоресценции за короткий промежуток времени (35 мин) позволяет с высокой степенью достоверности установить диагноз на хламидиоз.

Источники информации
Нагиева Ф.Г., Шафикова Р.А., Никулина В.Г. и др. Моноклональные антитела к Ch. psittaci: получение, характеристика и применение. Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1991, 10, 58-61.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и может быть использовано для получения штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (М-АТ) к антигенам Chlamydia. Штамм Хла-К-1 получают путем слияния мышиных миеломных клеток NSO с клетками спленоцитов мышей линии BALB/c, иммунизированных элементарными тельцами Chlamydia psittaci, приготовленных из штамма К-1, возбудителя хламидиозного конъюнктивита кошек. Гибридома Хла-К-1 продуцирует родоспецифические М-АТ изотипа Gl, реагирующие с различными штаммами возбудителей хламидиоза кошек, овец, пушных зверей и человека. Активность М-АТ в культуральной жидкости 1:2000 - 1:6000, в асцитной жидкости 1:200000 - 1:1000000. М-АТ выявляют в иммуноферментном тесте, иммунофлюоресценции. Штамм позволяет приготовить экспресс-диагностикум для обнаружения антигенов рода Chlamydia. 1 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток ВГНКИ Хла-К-1 ДЕП животных Mus. musculus L., используемый для получения моноклональных антител к Chlamydia.