СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ И НИЗШИХ ПЕПТИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C12P13/04 A23J1/18 

Изобретение относится к способам изготовления пищевых веществ, точнее к способам получения из дрожжей смеси аминокислот и низших пептидов, пригодных для использования в пищевой промышленности, медицине.

Известны способы получения смеси аминокислот и пептидов из дрожжевой биомассы путем плазмолиза, термолиза, механического разрушения, кислотного, щелочного или ферментативного гидролиза, автолиза.

Кислотный гидролиз относится к химическому способу переработки белкового сырья. Для этого способа используют серную кислоту или соляную кислоту различных концентраций. Иногда применяют ортофосфорную кислоту, органические кислоты или их смеси. Сернокислотный гидролиз проводят, как правило, в течение 3-5 часов при 120-130^oC и избыточном давлении 0,2-0,3 МПа (Васильев П. С. и др. Современные кровезаменители. М. ВНИИМИ, 1980, с.28-43). Процесс солянокислого гидролиза протекает при температуре кипения и небольшом избыточном давлении (Тубольцев А.К. и др. //Биотехнология, 1986, N 4, c. 96-101).

Однако кислотные способы гидролиза имеют ряд существенных недостатков. Так, например, при кислотном гидролизе большая часть образующихся аминокислот, таких как триптофан, цистин, серин и треонин, осмоляется и разрушается (Грачева И.М. и др. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М. Пищевая промышленность, 1980, с. 366). При этом имеет место конденсация образующихся аминокислот с углеводами с образованием токсичных веществ мелантоидинов, фурфурола (Проблемы парантерального питания. Рига: Зинатне, 1969, с. 56-88. Материалы первого совещания по парентеральному питанию). Особенно много меланоидов образуется при гидролизе хлебопекарных дрожжей. Другим существенным недостатком кислотного гидролиза является необходимость нейтрализации гидролизата и его очистки от образующихся при этом солей. Все это удорожает производство смеси аминокислот и не позволяет использовать непосредственно реакционную смесь гидролизат в пищу для человека. Выделенные из гидролизата аминокислоты с помощью ионообменных смол не содержат витаминов группы В и микроэлементов, а также других биологически активных компонентов, например липидов.

Приготовление белковых гидролизатов путем щелочного гидролиза не нашло широкого применения, поскольку также имеет ряд существенных недостатков (Неклюдов А.Д. и др. //Прикл. биохим. микробиол. 1986, т. 14, с. 3-17). Так, например, при щелочном гидролизе происходят рацемизация, дезаминирование и разложение многих аминокислот. Практически полностью разрушаются серин, аргинин, цистин, цистеин. Гидролизат также требует нейтрализации и выделения из него оставшихся аминокислот анионообменными смолами из-за большого количества солей, образующихся на стадии нейтрализации.

Известен способ получения смеси аминокислот на основе ферментативного гидролиза дрожжей (Производство и применение продуктов микробиологических производств. Обзорная информация, вып. 8. М. 1989, с. 16; Шкляр Б.К. Ферментативный лизис дрожжей. Минск: Наука и техника, 1977).

При ферментативном гидролизе аминокислоты не разрушаются, но требуется сложная подготовка сырья, в гидролизатах остается введенный ранее лизирующий фермент или продукты его частичного разрушения, что также требует использования сорбентов для селективного выделения аминокислот. При этом теряются образующиеся в ходе гидролиза витамины группы В, а также микроэлементы.

Известен способ получения смеси аминокислот и низших пептидов путем самораспада клеток дрожжей под действием содержащихся в них (внутриклеточных) гидролитических ферментов. Указанный способ известен под названием "автолиз" (Яковлев В. И. Технология микробиологического синтеза. Л. Химия, 1987, с. 257). Процесс осуществляют в водной среде при температуре 65-100^oC в течение 25-76 часов.

Однако выход аминокислот недостаточен, процесс требует больших энергетических затрат.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения смеси аминокислот и низших пептидов путем плазмолиза (заявка ФРГ N 2503868, кл. A 23 K 1/00, A 23 J 1/18, опубл. 1976; а. с. СССР N 771154, кл.C 12 D 13/06 A 23 J 1/18, 1979). Способ основан на предварительной дезинтеграции дрожжевых клеток с последующим их автолизом. Так, например, в способе-прототипе водную суспензию дрожжей в количестве 50 кг нагревают до 40-55^oC в присутствии 0,6 кг толуола в течение 15-20 часов (а. с. СССР N 602543, кл. C 12 D 13/06; A 23 J 1/18). Последний вызывает разрыв клеточной мембраны дрожжей и выход плазмы клеток в водную среду. Освобожденные указанным образом клеточные лизирующие ферменты осуществляют автолиз клеточного белка до аминокислот, витаминов и низших пептидов.

После завершения процесса автолизат обесцвечивают анионообменной смолой и выделяют аминокислоты с помощью катионообменной смолы. Десорбцию осуществляют 1,5% -ным раствором аммиака. Готовый продукт получают после распылительной сушки. Из 50 кг прессованных пекарских дрожжей получают 2,6-3,0 кг чистой смеси аминокислот и низших пептидов, 0,4-0,5 кг смеси нуклеиновых компонентов и 3,5-4,5 кг чистого эргостерина.

Однако данный способ также имеет ряд существенных недостатков. Так, например, первоначальная дезинтеграция клеток протекает под влиянием высокотоксичного ароматического углеводорода, который имеет способность накапливаться в организме человека. Поэтому гидролизат не используют непосредственно, а смесь аминокислот выделяют сложным и дорогостоящим способом с помощью сорбентов. При этом готовый продукт теряет микроэлементы и витамины. В ходе распылительной сушки α-аминокислоты теряют также часть своих функциональных групп вследствие реакции конденсации при повышенной температуре. Процесс получения аминокислот и их выделения из реакционной смеси длителен, энергоемок и дает сравнительно низкий выход продукта.

Целью предлагаемого изобретения является получение автолизата, содержащего смесь аминокислот и низших пептидов, пригодного для непосредственного использования, а также упрощения способа, повышение выхода целевых продуктов, снижение времени процесса.

Цель достигается тем, что для предварительной дезинтеграции дрожжевых клеток используют электрический ток.

Сущность изобретения состоит в том, что для предварительной дезинтеграции микроклеток и высвобождения из них лизирующих ферментов предложено использовать известное явление электроосмоса. Для этого суспензию дрожжей помещают в электролитическую ванну, содержащую анодный и катодный электроды, отделенные друг от друга полупроницаемой мембраной. При прохождении постоянного тока через водную суспензию микроклеток в последних наблюдается электроперенос воды. Развивающееся электроосмотическое давление на клетку приводит к ее дезактивации путем разрыва ее мембраны. Плазма клетки переходит в водную среду и обеспечивает последующий лизис клеточного белка до аминокислот, низших пептидов, витаминов и микроэлементов. Поскольку автолизат не требует очистки, он может быть непосредственно употреблен в пищу. При добавлении ароматизирующих добавок или газировании получают освежающе-кислый автолизат, который является прекрасным напитком, утоляющим жажду. Он содержит все аминокислоты в том сочетании, в котором организм человека привык получать их в ходе эволюции. Кроме того, в нем сохранены все витамины группы В, начиная от В₁ и кончая В₁₂, а также В_х. В нем сохранены все микроэлементы, потребные человеку: железо, калий, магний, медь, кобальт, цинк. В нем сохранены все биологически активные компоненты, потребные человеку: липиды, пептиды. Автолизат в количестве 200 мл удовлетворяет суточную потребность человека в строительном материале для синтеза белка в аминокислотах, ферментах и микроэлементах.

Предложенный способ предварительной дезинтеграции дрожжевых клеток достоверен и опробирован нами ранее на дезинтеграции сростков слюды, а также бентонитовых глин (а.с. СССР N 1350155, кл. C 04 B 33/04, 1985; N 1280817, кл. B 28 D 1/32).

Так, под действием электроосмоса вода поступает в межплоскостные пространства кристаллов слюды, отделяя тем самым пластины слюды друг от друга. Понимание механизма дезинтеграции кристаллов слюды электроосмосом позволило предположить возможность его применения по отношению к клеточным организмам, имеющим полупроницаемую оболочку клеточную мембрану. Электроосмос позволяет дезактивировать микроклетки, не прибегая к повышенным температурам, и тем самым избежать коагуляции белковых структур, из которых они состоят. Это позволяет получить мономерные аминокислоты, непосредственно пригодные для синтеза белковых структур в организме человека.

Пример 1. В стерильный смеситель, снабженный мешалкой, заливают 50 л кипяченой питьевой воды и добавляют 50 кг свежих прессованных пекарских дрожжей. В ходе перемешивания получают водную суспензию биомассы, которую непрерывно направляют в одну из ячеек электролитической ванны, отделенную от другой ячейки пористой мембраной из полимерного материала "Мипласт".

Сила тока 3 А/см², напряжение 220 В. Скорость подачи дрожжевой суспензии составляет 1 л/мин. Электроды выполнены из графита. На выходе обработанной суспензии из ячейки установлен заземленный токосъемный элемент, предохраняющий обслуживающий персонал от поражения током. Электролитическая ванна выполнена из диэлектрического материала. Дезинтегрированная дрожжевая суспензия подается в реактор, снабженный мешалкой и нагревательной рубашкой. Суспензию нагревают в реакторе в течение 1 часа при температуре 45^oC. После нагрева реакционную смесь направляют в промежуточную емкость, в которую добавляют пищевые ароматизирующие добавки, например квасной концентрат, в количестве 1,5% от веса суспензии. Смесь разливают в стеклянные бутылки и герметично укупоривают. После двухсуточного созревания при комнатной температуре напиток готов к употреблению. Анализ напитка на содержание аминокислот осуществляют с помощью анализатора "Хитачи" KLA-3Б с точностью ±3% (относительных). Питательную ценность оценивают отношением незаменимых аминокислот (Н) к общему азоту (О) в смеси, выраженной в граммах незаменимых аминокислот на 1 г общего азота. Результаты анализа приведены в табл. 1.

Опыты 2-5. В условиях примера 1 суспензию дрожжей подвергают предварительной дезинтеграции при силе тока: 1,5; 9; 18; 30 А/см² и скорости подачи суспензии: 0,5; 3; 5 и 8 л/мин. После нагревания при 47-52^oC в течение часа смесь облагораживают пищевой отдушкой, например ванилином или мятой, и герметично укупоривают в стерильную стеклянную тару. Результаты анализа продукта приведены в табл. 1.

Опыт 6 (про прототипу). В присутствии плазмолизирующего и стелизирующего агента толуола, взятого в количестве 0,6 кг, нагревают 12 л дистиллированной воды до 50^oC. Затем порциями туда загружают 50 кг свежих прессованных дрожжей. Аппарат герметично закрывают, и при перемешивании нагревают содержимое при 55^oC в течение 30 часов. Из реакционной смеси аминокислоты выделяют катионообменной смолой. Результаты анализа аминокислот, полученных после элюирования их со смол и распылительной сушки, приведены в табл. 1.

Для оценки состояния клеток в реакционной смеси на примере опытов 1-2 (табл. 1) был использован метод визуального наблюдения (микроскопом МБИ-14). В образцах были идентифицированы пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Клетки правильной формы, как крупные, так и мелкие. Оболочка утолщена. Заражения нет. Культура в угнетенном состоянии. В образце опыта 1 содержится 9% дезактивированных клеток вследствие разрыва их мембран посредством электроосмоса. В опыте 2 дезинтегрированных клеток не наблюдалось.

Анализ данных, приведенных в табл. 1, показывает, что при обработке водной суспензии пекарских дрожжей в течение 1 часа постоянным током в пределах 15-30 А/см² при 220 В имеет место выход свободных аминокислот из дрожжевых клеток в водную среду. Согласно п. 4 этой таблицы содержание свободных аминокислот нарастает от 56,5 до 79,6 г/кг дрожжей. В условиях прототипа образуется 57,0 г/кг свободных аминокислот, несмотря на время опыта, равное 30 часам.

Согласно п. 18 табл. 1 содержание незаменимых аминокислот в опытах 1-5 нарастает от 60,4 до 94,1 г/на 16 г общего азота. В условиях прототипа содержание незаменимых аминокислот составляет 61,4 г/на 16 г общего азота.

Опыт 7. В условиях опыта 1 (в анодное пространство электролитической ячейки, отделенной от катодного полупроницаемой мембраной) подают суспензию пивных дрожжей со скоростью 1 л/мин. Плотность тока на электродах -9 А/см², напряжение 36 В. Температура суспензии в ячейке поддерживается равной 52^oC. Время обработки клеток 20 мин. Содержание свободных аминокислот в водной среде, отделенной фильтрованием от твердой фазы, приведено в табл. 2.

Опыт 8. В условиях примера 7 в течение 20 мин обрабатывается суспензия пивных дрожжей при температуре 47^oC и плотности тока 3 А/см² при напряжении 36 В и скорости подачи суспензии 3 л/мин. Содержание свободных аминокислот в водной среде отражено в табл. 2.

Опыт 9. В течение 20 мин со скоростью подачи 5 л/мин обрабатывают суспензию пивных дрожжей при плотности тока 18 А/см² и напряжении 36 В. Температура опыта 62^oC.

Анализ опытов 7-9 осуществляли в сравнении с контрольным (опыт 10 без обработки током) на анализаторе ЛЦ 2000 (Биотроник-ФРГ), колонка 20 см с ионитом Дуррум ДЦ 6А в системе натриевых буферных растворов по специализированной программе анализа дрожжевых аминокислотных препаратов с послеколоночной дериватизацией нингидрином и детектированием по фотоабсорбции при 570 нм. Содержание сухих веществ в суспензии устанавливалось путем высушивания в течение 20 часов на воздухе при 105^oC с последующим взвешиванием образцов. Из анализа данных, приведенных в табл. 2, видно, что наибольшее суммарное содержание свободных аминокислот достигается в опыте 8 и равно 19,24 мг/мл (20,8% вес.), в опыте 7 оно равно 11,59 мг/мл (или 19,4% вес.), а в опыте 9 составляет всего 8,07 мг/мл (или 12,5% вес.). Опыт 10 - контрольный, на анализ был передан образец без обработки электрическим током. Содержание свободных кислот в водной среде в нем достигает 2,96 мг/мл (или 1,2% вес.) и объясняется жизнедеятельностью клеток.

Из сравнения опытов 7-9 видно, что на выход свободных аминокислот в водную фазу из клеток дрожжей оказывает влияние температура процесса. Так, например, в опыте 7 плотность тока в 3 раза выше, чем в опыте 8, однако выход свободных аминокислот практически не увеличился. Последнее объясняется развитием процесса термокоагуляции белков и аминокислот в дрожжевой клетке при 52^oC в опыте 7. В опыте 9 температура процесса еще выше, поэтому, несмотря на очень высокую плотность тока 18 А/см², выход свободных аминокислот составляет всего 12,5% вес. что значительно ниже, чем в опыте 8, в котором оптимальная температура.

Анализ данных табл. 1, 2 показывает, что процесс высвобождения аминокислот из дрожжевых клеток протекает в течение 20 мин-1 часа. В результате получаем гидролизат водный раствор свободных аминокислот, пригодный для непосредственного применения в пищу. Однако уменьшение плотности тока до 1,5 А/см² не оказывает существенного (по сравнению с прототипом) влияния на выход свободных аминокислот. Увеличение плотности тока до 30 А/см² не окупает энергетических затрат на то количество аминокислот, которое прибавляется по сравнению с их выходом при 18 А/см². Оптимальные условия находятся в пределах 1,5-18 А/см² при 45-50^oC.

Процесс характеризуется простотой и возможностью автоматизации и позволяет получить положительный эффект.

Использование: для получения из дрожжей смеси аминокислот и низших пептидов, пригодных для использования в пищевой промышленности и медицине. Сущность изобретения: способ предусматривает обработку водной суспензии дрожжей постоянным электрическим током в анодном пространстве электролитической ячейки, отделенном от катодного полупроницаемой мембраной. Плотность тока - 1,5-30,0 А/см. 2 табл.

Способ получения смеси аминокислот и низших пептидов, включающий обработку водной суспензии дрожжевых клеток с последующим нагреванием, отличающийся тем, что обработку осуществляют постоянным током в анодном пространстве электролитической ячейки, отделенном от катодного полупроницаемой мембраной, при плотности тока 1,5 30,0 а/см².